非小细胞肺癌细胞系PC-9耐药突变细胞株的建立及其对EGFR抑制剂的敏感性验证

• Published in: 中国肺癌杂志 Vol. 27; no. 11; pp. 815 - 825
• Main Authors: 胡涛, 楼洋, 苏明波
• Format: Journal Article
• Language: Chinese
• Published: 226133 南通,南通弘烨医药科技有限公司 2024; 226133 南通,南通弘烨医药科技有限公司%226133 南通,南通弘烨医药科技有限公司%226133 南通,长三角药物高等研究院; 230012 合肥,安徽中医药大学药学院; 226133 南通,长三角药物高等研究院
• Subjects: EGFR mutation; EGFR突变; CRISPR/Cas9 technology; CRISPR/Cas9技术; EGFR inhibitors; 肺肿瘤; EGFR抑制剂; Lung neoplasms
• ISSN: 1009-3419
• DOI: 10.3779/j.issn.1009-3419.2024.101.31

背景与目的 表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)激酶结构域的突变是非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)的关键发病因素,小分子EGFR-酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitors,TKIs)是治疗EGFR突变NSCLC的一线药物,而EGFR的耐药突变限制了EGFR-TKIs的临床应用.本研究旨在利用簇状规则间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)/CRISPR相关核酸酶9(CRISPR-associated nuclease 9,Cas9)基因敲入技术,构建贴近临床的具有EGFRD19/T790M/C797S突变类型的PC-9 EGFRD19/T790M/C797S细胞模型,用于研究小分子EGFR-TKIs的抑制作用及为新一代靶向EGFR突变耐药的创新药物研发提供细胞载体.方法 利用CRISPR/Cas9技术在EGFRD19突变类型的人NSCLC细胞PC-9上敲入EGFRT790M/C797S突变片段,构建具有EGFRD19/T790M/C797S突变类型的PC-9 EGFRD19/T790M/C797S细胞模型,以MTS法验证EGFR-TKIs对其增殖抑制作用,以Western blot证明EGFR蛋白表达以及下游蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)和丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)磷酸化调控.结果 成功构建EGFRD19/T790M/C797S突变的PC-9 EGFRD19/T790M/C797S细胞株,在增殖抑制上,已上市的第一、第二及第三代对EGFRD19/T790M/C797S突变无效的EGFR-TKIs对该细胞株的增殖抑制活性均较弱,增殖抑制半抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50)值均大于1000 nmol/L,而对EGFRD19/T790M/C797S突变具有较好疗效的在研的第四代EGFR-TKIs对该细胞模型具有较强的增殖抑制作用;在机制验证上,第一代、第二和第三代EGFR-TKIs对该细胞株EGFR及下游AKT/MAPK信号