成年小鼠触液神经元体外分离培养及自我更新能力的鉴定

• Published in: 中国组织工程研究 Vol. 29; no. 13; pp. 2728 - 2735
• Main Authors: 上官泽宇, 陈婵娟, 李琦哲, 谭伟, 颜海健, 王春庆, 豆晓伟, 李青
• Format: Journal Article
• Language: Chinese
• Published: 贵州医科大学附属医院创伤骨科,贵州省贵阳市 550004 2025; 贵州医科大学临床医学院,贵州省贵阳市 550025%贵州医科大学临床医学院,贵州省贵阳市 550025%贵州医科大学附属医院创伤骨科,贵州省贵阳市 550004%贵州医科大学附属医院临床研究中心,贵州省贵阳市 550004
• Subjects: spinal cord injury; 干细胞潜能鉴定; endogenous neural stem cell; 细胞提纯; self-renewal capacity; cell; 体外培养; culture in vitro; 内源性神经干细胞; 成年小鼠触液神经元; 融合多模态成像基因的慢病毒; adult mouse cerebrospinal fluid-contacting neuron; 脊髓损伤; 自我更新能力
• ISSN: 2095-4344
• DOI: 10.12307/2025.028

R459.9%R363%R364; 背景:课题组前期成功在体外分离培养乳鼠触液神经元,尚无研究报道有效分离培养高纯度成年小鼠触液神经元的方法,且触液神经元的自我更新能力是否随着年龄发生变化尚无研究. 目的:建立一种高纯度成年小鼠触液神经元体外分离培养的方法,并鉴定成年小鼠触液神经元与乳鼠触液神经元在体外的自我更新能力. 方法:从成年3月龄小鼠颈髓分离含有触液神经元的原代细胞贴壁培养并利用融合多模态成像基因的慢病毒转染细胞,通过嘌呤霉素筛选得到高纯度成年小鼠触液神经元细胞,在完全培养基中悬浮培养.通过免疫荧光检测成年小鼠触液神经元表达神经干细胞标记物巢蛋白(Nestin)及SOX2情况,观察成年小鼠触液神经元体外成球与传代能力;将同等数量(5×103)的第3代成年小鼠及乳鼠触液神经元在同等条件下分为2组,分别接种在含有完全培养基的超低黏附培养板中,在体积分数5％CO2,37℃恒温箱悬浮培养,通过体外成球、CCK8实验、qPCR和Western blot鉴定成年小鼠及乳鼠触液神经元的自我更新能力. 结果与结论:①实验成功在成年小鼠体内分离出高纯度触液神经元,在体外表达Nestin及SOX2,能形成神经球并连续传代.②成年小鼠触液神经元体外自我更新能力较乳鼠相比明显减弱,细胞培养到第4天时乳鼠触液神经元已经形成直径约为150μm的神经球,而成年小鼠触液神经元所形成的神经球直径仅为40μm(P<0.0001).③CCK8增殖实验结果表明,成年小鼠触液神经元的增殖活性在培养后各时间点显著弱于乳鼠(P<0.0001).④qPCR和Western blot检测发现成年小鼠触液神经元Nestin及SOX2的mRNA(P<0.0001)和蛋白表达量(P<0.01)较乳鼠显著下降.⑤上述结果证实,成年小鼠触液神经元的体外自我更新能力显著弱于乳鼠.