抗体基因点突变、插入和缺失体外检测方法的建立及应用

• Published in: 上海交通大学学报（医学版） Vol. 42; no. 4; pp. 518 - 527
• Main Authors: 罗思敏, 叶菱秀, 郝茜
• Format: Journal Article
• Language: Chinese
• Published: 上海交通大学基础医学院免疫学与微生物学系,上海市免疫学研究所,上海 200025 2022
• Subjects: 点突变; 激活诱导胞苷脱氨酶; 缺失; 插入
• ISSN: 1674-8115
• DOI: 10.3969/j.issn.1674-8115.2022.04.015

R392.33; 目的·建立由激活诱导胞苷脱氨酶(activation-induced cytidine deaminase,AID)引起的体细胞高频突变过程中,快速检测抗体基因可变(variable,V)、多样(diversity,D)、连接(joining,J)区发生突变(包括点突变、插入和缺失事件)的体外方法.应用该方法检测经2种DNA聚合酶β(polymeraseβ,Polβ)抑制剂处理的细胞中抗体基因VDJ片段的突变情况.方法·用慢病毒感染法处理CH12F3细胞(即处理组),感染前的CH12F3细胞为对照组.采用蛋白质印迹法(Western blotting)检测2组细胞中AID的表达水平.构建高通量测序文库,应用生物信息学的方法分析处理组和对照组细胞中抗体基因VDJ片段的点突变、插入及缺失频率.采用不同浓度的Polβ抑制剂[扎西他滨(2',3'-dideoxycytidine,DDC)、5-甲氧基黄铜(5-methoxyflavone,5-MF)]处理CH12F3细胞,并采用台盼蓝拒染法测定该2种抑制剂对细胞增殖的影响.分别以筛选得到的DDC浓度、5-MF浓度处理CH12F3细胞(即实验组),以0.9％NaCl处理的细胞及DMSO处理的细胞依次记为上述实验组的对照组,使用上述已建立的方法进行处理,最终行高通量测序,分析该2种抑制剂对抗体基因VDJ片段中点突变、插入及缺失频率的影响.结果·Western blotting结果显示,和CH12F3细胞对照组相比,CH12F3细胞处理组中AID表达较高;且高通量测序结果显示,该组在抗体基因VDJ片段上存在大量的点突变,且插入和缺失的频率均较高(均P=0.000).台盼蓝拒染法检测显示,处理CH12F3细胞最适宜的DDC浓度为100μmol/L、5-MF浓度为25μmol/L.最终的高通量测序结果显示,和0.9％NaCl对照组相比,经100μmol/L DDC处理的细胞在抗体基因VDJ片段的点突变频率较低(P=0.000),长度为1 bp的缺失频率亦较低(P=0.009);和DMSO对照组相比,经25μmol/L 5-MF处理的细胞在抗体基因VDJ片段的点突变频率较低(P=0.000),长度大于1 bp的插入和缺失频率亦有所下降(均P=0.000).