红豆杉TcERF基因qRT-PCR体系构建与优化

• Published in: 农业生物技术学报 Vol. 28; no. 6; pp. 149 - 157
• Main Authors: 蒋路园, 王旭, 张恺恺, 陈段芬, 邱德有, 杨艳芳
• Format: Journal Article
• Language: Chinese
• Published: 河北农业大学园艺学院,保定071001 2020; 中国林业科学研究院林业研究所,林木遗传育种国家重点实验室/国家林业局林木培育重点实验室,北京100091%河北科技师范学院园艺科技学院,秦皇岛,066004%河北农业大学园艺学院,保定,071001%中国林业科学研究院林业研究所,林木遗传育种国家重点实验室/国家林业局林木培育重点实验室,北京100091
• Subjects: 正交试验; 乙烯响应因子(ERF); qRT-PCR; 红豆杉
• ISSN: 1674-7968
• DOI: 10.3969/j.issn.1674-7968.2020.06.015

S718.46; 红豆杉(Taxus sp.)能够产生天然抗癌药物紫杉醇(taxol),但含量极低,开发与利用之间存在严重矛盾.乙烯响应因子(APETALA2/ethylene-responsive factor,AP2/ERF)对红豆杉中紫杉醇的生物合成起到重要调控作用.研究组前期获得了1个红豆杉ERF转录因子基因(命名为TcERF),为了更好地研究该基因的功能,本研究以曼地亚红豆杉(Taxus×media)愈伤组织为实验材料,采用正交实验L9(34)方法,根据TcERF基因序列设计、组合出3对引物,从qRT-PCR反应体系、cDNA模板用量和引物用量等方面进行优化,分别筛选出该基因在5μL小反应体系及10、20μL常用体系下的最佳组合.结果表明,在本研究优化后的5μL体系下,TcERF和看家基因:3,5-表异构酶-4-还原酶(3,5-epimerase-4-reductase,TBC41)基因的扩增效率分别为90％和94％;在优化后的10μL下,TcERF和TBC41的扩增效率分别为94％和95％;在优化后的20μL下,TcERF和TBC41的扩增效率分别为102％和93％,以上各扩增体系回归系数R2均大于0.980.以茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)处理24 h的红豆杉愈伤组织为材料,利用优化前和优化后的10μL体系检测并比较TcERF基因的表达,发现两个体系下该基因表达水平存在显著性差异,充分表明建立并优化qRT-PCR实验体系的必要性和重要性.本研究建立的3个qRT-PCR反应体系均可以保证红豆杉TcERF基因和看家基因具有接近100％的扩增效率,为后续该基因转录水平的表达检测以及功能研究提供了实验条件和技术支撑.