苹果树腐烂病菌木聚糖酶VmXyl1基因的原核表达及多克隆抗体制备

• Published in: 农业生物技术学报 Vol. 27; no. 2; pp. 315 - 322
• Main Authors: 孟璐璐, 于春蕾, 练森, 李保华, 梁文星, 王彩霞
• Format: Journal Article
• Language: Chinese
• Published: 青岛农业大学植物医学学院/山东省植物病虫害综合防控重点实验室/山东省应用真菌重点实验室,青岛,266109 2019
• Subjects: 木聚糖酶基因; 原核表达; 苹果树腐烂病菌; 多克隆抗体
• ISSN: 1674-7968
• DOI: 10.3969/j.issn.1674-7968.2019.02.014

S436.611.11; 木聚糖酶(xylanase)基因VmXyl1在苹果树腐烂病菌一黑腐皮壳菌(Valsa mali)致病过程中发挥重要作用.为了揭示VmXyl1在腐烂病菌与寄主互作过程中的作用机制,本研究构建了原核表达载体pET-32a-VmXyl1,利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)进行诱导,在大肠杆菌(Escherichia coli)表达菌株Rosetta (DE3)中成功表达了VmXyll融合蛋白;利用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)检测融合蛋白的可溶性和纯化效果,免疫新西兰白兔(Oryctolagus cuniculus)制备多克隆抗体,并对其效价和特异性进行分析.结果显示,该蛋白主要以包涵体形式存在,且0.5 mmol/L IPTG、30℃诱导8h融合蛋白高效表达;经Ni-NTA柱亲和层析纯化后,获得了预期大小的融合蛋白.酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)和Western blot分析表明,所制备抗体效价达1:102 400,且抗体能特异性识别VmXyl1融合蛋白及发病苹果(Malus pumila)树皮组织中的木聚糖酶蛋白,说明所制备的抗体具有高效性和特异性.研究结果为深入探究腐烂病菌木聚糖酶的致病机理及其与寄主的互作机制提供了基础资料.