高亲和力抗eGFP纳米抗体的筛选与应用

• Published in: 南昌大学学报（理科版） Vol. 45; no. 1; pp. 34 - 40
• Main Authors: 刘晓芳, 刘贝, 周方月, 黄云祥, 钟引凤, 张茹云, 梁宇芳, 王丹, 付金衡
• Format: Journal Article
• Language: Chinese
• Published: 南昌大学 中德联合研究院,江西 南昌 330047%南昌大学 中德联合研究院,江西 南昌 330047%江西农业大学,江西 南昌 330045 2021; 南昌大学 生命科学学院,江西 南昌 330031
• Subjects: eGFP; IP; 纳米抗体; 噬菌体展示; ELISA
• ISSN: 1006-0464
• DOI: 10.3969/j.issn.1006-0464.2021.01.007

Q819; 将增强型绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein,eGFP)免疫羊驼后构建纳米抗体免疫库,固相淘选eGFP纳米抗体;构建E.coli Rosetta表达载体,诱导表达纳米抗体,并鉴定其结合活性及特异性;辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase,HRP)标纳米抗体,确定其工作浓度及稳定性;将纳米抗体与纳米磁珠偶联应用于免疫沉淀B13-EGFP融合蛋白.四免后抗血清滴度超过1.28×106,获得库容量为1.85×108 cfu的抗eGFP纳米抗体噬菌体展示文库;原核表达10种独特基因序列的纳米抗体,均为可溶性表达;采用ForteBio Octet确定出纳米抗体4-28与eGFP的亲和常数(KD)最高,达到9.67×10-11 M;纳米抗体4-28与eGFP、绿色荧光蛋白(Green Fluo-rescent Protein,GFP)特异性结合;HRP标记纳米抗体4-28检测范围是1:10000～1:25000(浓度100～40 ng·mL-1),比市场上现有的检测二抗(稀释范围1:5000～1:20000)灵敏度更高;纳米抗体4-28偶联羧基化纳米磁珠,免疫沉淀B13-eGFP融合蛋白,实现了简单快速分离目的蛋白B13-eGFP.