斑马鱼hoxc8a基因敲除品系的构建及其对脊柱发育的影响

Q812; hoxc8a基因是Hox基因家族中的成员,该基因家族在进化上高度保守.已有研究表明,hoxc8a基因在斑马鱼的鱼鳔和胸鳍中表达,且Hox基因能影响脊椎动物体轴的形成和发育,但hoxc8a基因的作用机制尚不明确.为了研究该基因的发育生物学功能及分子调控的机制,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对hoxc8a基因进行敲除.首先,在hoxc8a基因的第一号外显子上设计靶位点以及基因型检测引物,经PCR扩增得到向导DNA(sgDNA);接着,对sgDNA进行纯化回收,以纯化的sgDNA作为模板进行体外转录合成向导RNA(sgRNA);最后,进行RNA纯化.将sgRNA和Cas9蛋白按1...

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Published in激光生物学报 Vol. 33; no. 6; pp. 557 - 566
Main Authors 谭媛媛, 李玲环, 杨艳群, 刘玲, 王欣怡, 廖贝雅, 熊蕾, 谢华平
Format Journal Article
LanguageChinese
Published 湖南师范大学动物营养与人体健康实验室,长沙 410081%郴州市科技创新服务中心,郴州 423000 2024
Subjects
斑马鱼
脊柱发育
基因敲除品系
homozygous mutant
hoxc8a
zebrafish
spinal development
gene knockout line
突变体纯合子
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ISSN1007-7146
DOI10.3969/j.issn.1007-7146.2024.06.010

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Summary:Q812; hoxc8a基因是Hox基因家族中的成员,该基因家族在进化上高度保守.已有研究表明,hoxc8a基因在斑马鱼的鱼鳔和胸鳍中表达,且Hox基因能影响脊椎动物体轴的形成和发育,但hoxc8a基因的作用机制尚不明确.为了研究该基因的发育生物学功能及分子调控的机制,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对hoxc8a基因进行敲除.首先,在hoxc8a基因的第一号外显子上设计靶位点以及基因型检测引物,经PCR扩增得到向导DNA(sgDNA);接着,对sgDNA进行纯化回收,以纯化的sgDNA作为模板进行体外转录合成向导RNA(sgRNA);最后,进行RNA纯化.将sgRNA和Cas9蛋白按1:1:0.8的比例混合,利用显微注射技术将混合液注射到野生型斑马鱼胚胎中,经基因型鉴定筛选出F0代突变体斑马鱼.待F0代斑马鱼性成熟后与野生型斑马鱼进行杂交,其子代斑马鱼经基因型鉴定筛选得到F1代突变体杂合子,进行Sanger测序后保留突变类型为移码突变的F1代鱼,继续培育至成鱼.将F1代斑马鱼成鱼自交,对其子代进行基因型鉴定,筛选得到F2代hoxc8a突变体纯合子.最后,通过对突变体纯合子和野生型斑马鱼幼鱼进行钙黄绿素染色试验,发现基因敲除突变体的脊柱发育情况与野生型无显著差异,说明hoxc8a基因不影响斑马鱼早期脊柱的发育,但是该基因是否影响其他组织器官的发育仍有待进一步研究.本研究构建了斑马鱼hoxc8a基因敲除品系,为hoxc8a基因更深入的研究提供了基础.
ISSN:1007-7146
DOI:10.3969/j.issn.1007-7146.2024.06.010