COVALENTLY MODIFIED TEMPLATE-INDEPENDENT DNA POLYMERASE AND METHODS OF USE THEREOF

• Main Authors: MORAN, Isaac, COLEMAN, Rachel, DOYLE, Robert, SPRACHMAN, Melissa M, DOE, Robert E, BRYAN, Cassie M, MAGYAR, Andrew P, RECORDS, William C, GRISWOLD, JR, RODRIGUEZ, Juan Carlos
• Format: Patent
• Language: English; French
• Published: 21.03.2024
• Subjects: APPARATUS THEREFOR; BEER; BIOCHEMISTRY; CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOIDCHEMISTRY; CHEMISTRY; COMBINATORIAL CHEMISTRY; COMPOSITIONS THEREOF; CULTURE MEDIA; DERIVATIVES THEREOF; ELECTROLYTIC OR ELECTROPHORETIC PROCESSES; ELECTROLYTIC OR ELECTROPHORETIC PROCESSES FOR THE PRODUCTIONOF COMPOUNDS OR NON-METALS; ENZYMOLOGY; FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIREDCHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERSFROM A RACEMIC MIXTURE; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES, IN SILICOLIBRARIES; METALLURGY; MICROBIOLOGY; MICROORGANISMS OR ENZYMES; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; NUCLEIC ACIDS; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; ORGANIC CHEMISTRY; PERFORMING OPERATIONS; PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL; PROPAGATING, PRESERVING OR MAINTAINING MICROORGANISMS; SPIRITS; SUGARS; THEIR RELEVANT APPARATUS; TRANSPORTING; VINEGAR; WINE

Provided herein are engineered terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) proteins with certain modifications, including mutations to confer thermal stability and to install an exposed amino acid residue to which a small molecule can be covalently tethered via bioconjugate chemistries such as click chemistry. Also provided herein are methods of nucleic acid molecule synthesis using engineered TdTs and nucleotide molecules attached to redox-cleavable linkers, wherein the engineered TdT incorporates the nucleotide molecule into a nucleic acid strand and is separated from the nucleotide molecule when the redoxcleavable linker is cleaved upon exposure to suitable electrochemical conditions. Also provided herein are engineered TdTs covalently attached to a nucleotide molecule via a tether and also nucleotide molecules comprising a redox-cleavable linker. Further provided herein are systems for enzymatic DNA synthesis comprising an engineered TdT, a redox-cleavable linker a redox shuttle solution, and two or more electrodes. La présente invention concerne des protéines de désoxyribonucléotidyl-transférase terminale (TdT) modifiées présentant certaines modifications, dont des mutations pour conférer une stabilité thermique et pour installer un résidu d'acide aminé exposé auquel une petite molécule peut être attachée par covalence via des chimies bioconjuguées comme la chimie clic. La présente invention concerne également des procédés de synthèse de molécules d'acide nucléique à l'aide de TdT modifiées et de molécules nucléotidiques attachées à des lieurs clivables par redox, la TdT modifiée incorporant la molécule nucléotidique dans un brin d'acide nucléique et étant séparée de la molécule nucléotidique lorsque le lieur clivable par redox est clivé lors de l'exposition à des conditions électrochimiques appropriées. La présente invention concerne également des TdT modifiées attachées par covalence à une molécule nucléotidique via une attache et également des molécules nucléotidiques comprenant un lieur clivable par redox. La présente invention concerne en outre des systèmes de synthèse d'ADN enzymatique comprenant une TdT modifiée, un lieur clivable par redox et une solution de navette redox, et au moins deux électrodes.