METHOD FOR CDNA LIBRARY CONSTRUCTION AND ANALYSIS FROM TRANSFER RNA

• Main Authors: NEDIALKOVA, Danny D, BEHRENS, Andrew, RODSCHINKA, Geraldine
• Format: Patent
• Language: English; French
• Published: 23.02.2023
• Subjects: BEER; BIOCHEMISTRY; CHEMISTRY; COMPOSITIONS THEREOF; CULTURE MEDIA; ENZYMOLOGY; METALLURGY; MICROBIOLOGY; MICROORGANISMS OR ENZYMES; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; PROPAGATING, PRESERVING OR MAINTAINING MICROORGANISMS; SPIRITS; VINEGAR; WINE

The present invention relates to a method for the generation of a cDNA library from transfer RNA (tRNA) comprising (a) optionally ligating at least one DNA adapter to the 3'-end oftRNA, wherein the 3'-end of the DNA adapter is preferably a chain terminator dideoxycytidine, preferably under one or more of the following conditions: (i) crowding reagent at 5% to 35%, preferably 15% to 30%, and most preferably about 25%, (ii) MgCI2 concentration of 1 mM to 15 mM, preferably 3 to 12 mM and most preferably about 10 mM (iii) a temperature of 12°C to 37°C, preferably of about 25°C. (iv) a pH of 6.0 to 9.0, preferably 6.5 to 8.0 and most preferably about 7.0, (v) reducing agent concentration of 0.1 mM to 10 mM, preferably 0.5 to 5 mM and most preferably about 1 mM, and (vi) a reaction time of at least 30 min, preferably at least 1.5 h and most preferably at least 3 h; and (b) reverse transcription in a primer- dependent reaction, in case step (a) is present, or in a template-switching reaction, in case step (a) is absent, of tRNAs into cDNA by a group II intron reverse transcriptase, under the following conditions: (i) KCI or NaCI at a concentration of 20 mM to 250 mM, preferably 50 to 100 mM and most preferably about 75 mM, (ii) MgCh at a concentration of 0.5 mM to 15 mM, preferably 1 to 5 mM and most preferably about 3 mM, (iii) a temperature of 30°C to 65°C, preferably of about 42°C, and (iv) a reaction time of at least 2 h, preferably at least 8 h and most preferably at least 15 h, and preferably (v) a pH of 6.5 to 9.5, preferably 7.0 to 8.5 and most preferably about 8.0, and/or (vi) a reducing agent (DTT) at a concentration of 1 mM to 12.5 mM, preferably 3 to 8 mM and most preferably about 5 mM. La présente invention concerne un procédé pour la génération d'une banque d'ADNc à partir d'ARN de transfert (ARNt) comprenant les étapes suivantes : (a) ligature facultative d'au moins un adaptateur d'ADN à l'extrémité 3' de l'ARNt, l'extrémité 3' de l'adaptateur d'ADN étant de préférence un facteur de terminaison de chaîne, la didésoxycytidine, de préférence dans une ou plusieurs des conditions suivantes : (i) un réactif d'encombrement de 5 % à 35 %, de préférence de 15 % à 30 % et le plus préférablement d'environ 25 %, (ii) une concentration de MgCI2 de 1 mM à 15 mM, de préférence de 3 à 12 mM et le plus préférablement d'environ 10 mM, (iii) une température de 12°C à 37°C, de préférence d'environ 25°C, (iv) un pH de 6,0 à 9,0, de préférence de 6,5 à 8,0 et plus préférablement d'environ 7,0, (v) une concentration d'agent réducteur de 0,1 mM à 10 mM, de préférence de 0,5 à 5 mM et plus préférablement d'environ 1 mM, et (vi) un temps de réaction d'au moins 30 min, de préférence d'au moins 1,5 h et plus préférablement d'au moins 3 h ; et (b) transcription inverse dans une réaction dépendante de l'amorce, dans le cas où l'étape (a) est présente, ou dans une réaction de changement de matrice, dans le cas où l'étape (a) est absente, d'ARNt en ADNc par une transcriptase inverse d'intron du groupe II, dans les conditions suivantes : (i) KCI ou NaCI à une concentration de 20 mM à 250 mM, de préférence de 50 à 100 mM et tout particulièrement d'environ 75 mM, (ii) MgCh à une concentration de 0,5 mM à 15 mM, de préférence de 1 à 5 mM et tout particulièrement d'environ 3 mM, (iii) une température de 30°C à 65°C, de préférence d'environ 42°C, et (iv) un temps de réaction d'au moins 2 h, de préférence d'au moins 8 h et tout particulièrement d'au moins 15 h, et de préférence (v) un pH de 6. 5 à 9,5, de préférence 7,0 à 8,5 et le plus préférablement environ 8,0, et/ou (vi) un agent réducteur (DTT) à une concentration de 1 mM à 12,5 mM, de préférence 3 à 8 mM et le plus préférablement environ 5 mM.