A METHOD FOR THE POSITIVE SELECTION OF CHROMOSOMAL MUTATIONS IN C1 METABOLIZING BACTERIA VIA HOMOLOGOUS RECOMBINATION

• Main Authors: SHARPE, PAMELA, L, CHENG, QIONG, BOSAK, MELISSA, D, TAO, LUAN
• Format: Patent
• Language: English; French
• Published: 29.09.2005
• Edition: 7
• Subjects: BEER; BIOCHEMISTRY; CHEMISTRY; COMPOSITIONS THEREOF; CULTURE MEDIA; ENZYMOLOGY; FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIREDCHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERSFROM A RACEMIC MIXTURE; METALLURGY; MICROBIOLOGY; MICROORGANISMS OR ENZYMES; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; PROPAGATING, PRESERVING OR MAINTAINING MICROORGANISMS; SPIRITS; VINEGAR; WINE

A method for the positive selection of allelic exchange mutants is provided for C1 metabolizing bacteria. The chromosomal integration vectors, based on the pGP704 suicide vector, comprise at least one genetic selectable marker and the sacB gene, encoding levansucrase. A one- and two-step selection strategy is provided for the facile identification of double-crossover mutations in C1 metabolizing bacteria. This methodology enables production of "markerless" transformants, such that multiple rounds of mutation can be performed. Optimized conditions for conjugal transfer, homologous recombination, transformant purification, and screening are also presented. La présente invention concerne un procédé de sélection positive de mutations par modification allélique chez des bactéries de métabolisation C1. Les vecteurs d'intégration chromosomique, basés sur le vecteur suicide pGP704, comprennent au moins un marqueur génétique qui peut être sélectionné, et le gène sacB qui code pour la levansucrase. Une stratégie de sélection en une ou deux étapes, permet une identification aisée de mutations par double enjambement chez des bactéries de métabolisation C1. Cette méthode permet la production de transformants "sans marqueur", de sorte que de multiples séries de mutations peuvent être réalisées. L'invention a également pour objet des conditions optimisées pour le transfert par conjugaison, la recombinaison homologue, la purification de transformant, et le criblage.