METHOD FOR THE AMPLIFICATION AND DETECTION OF DNA USING A TRANSCRIPTION BASED AMPLIFICATION

• Main Authors: DEIMAN, BIRGIT, ALBERTA, LOUISA, MARIA, STRIJP, ARNOLDINA, MARGARETHA, WILHELMINA, FRANTZEN, INGE, MARJOLEIN
• Format: Patent
• Language: English; French
• Published: 28.08.2003
• Edition: 7
• Subjects: BEER; BIOCHEMISTRY; CHEMISTRY; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; COMPOSITIONS THEREOF; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL ORENZYMOLOGICAL PROCESSES; CULTURE MEDIA; ENZYMOLOGY; MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEICACIDS OR MICROORGANISMS; METALLURGY; MICROBIOLOGY; MICROORGANISMS OR ENZYMES; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; PROPAGATING, PRESERVING OR MAINTAINING MICROORGANISMS; SPIRITS; VINEGAR; WINE

The present invention is directed to a transcription based amplification method for the amplification of DNA targets starting from ds or ssDNA optionally present in a sample, comprising the steps of: - incubating the sample in an amplification buffer with one or more restriction enzymes capable of cleaving DNA at a selected restriction site, said restriction enzyme creating a defined 3' end on the said DNA strand(s), and a promoter-primer, said promoter-primer having a 5' region comprising the sequence of a promoter recognized by a DNA-dependent RNA polymerase and a 3' region complementary to the defined 3' end of the DNA strand, a second primer, having the opposite polarity of the promoter-primer and comprising the 5' end of the target sequence, and in case of ssDNA as the target DNA, a restriction primer; - maintaining the thus created reaction mixture under the appropriate conditions for a sufficient amount of time for a digestion by the restriction enzyme to take place; - subjecting the sample to a heat treatment at a temperature and time sufficient to inactivate the restricting enzyme and/or to render a double strand single stranded; - adding the following reagents to the sample: an enzyme having RNA dependent DNA polymerase activity, an enzyme having DNA dependent DNA polymerase activity, an enzyme having Rnase H activity, an enzyme having RNA polymerase activity; and - maintaining the thus created reaction mixture under the appropriate conditions for a sufficient amount of time for the amplification to take place. L'invention porte sur un procédé d'amplification fondée sur la transcription afin d'amplifier des cibles d'ADN commençant à partir d'ADN monocaténaire ou bicaténaire éventuellement présents dans un échantillon. Ce procédé consiste: à incuber l'échantillon dans un tampon d'amplification avec au moins une enzyme de restriction capable de couper l'ADN à un endroit de restriction sélectionné, ladite enzyme de restriction créant une extrémité 3' définie sur le/les brin(s) d'ADN, et un promoteur-amorce, ledit promoteur-amorce comprenant une zone 5' comportant la séquence d'un promoteur reconnu par une ARN polymérase dépendant de l'ADN et une zone 3' qui complète l'extrémité 3' définie du brin d'ADN, une seconde amorce possédant la polarité opposée du promoteur-amorce et comprenant l'extrémité 5' de la séquence cible, et dans le cas de l'ADN monocaténaire en tant qu'ADN cible, une amorce de restriction ; à maintenir le mélange de réaction ainsi créé dans des conditions adéquates et pendant une durée suffisante pour que l'enzyme de restriction puisse effectuer une digestion ; à soumettre l'échantillon à un traitement thermique à une température et pendant une durée suffisantes pour désactiver l'enzyme de restriction et/ou transformer un brin double en brin unique ; à ajouter les réactifs suivants dans l'échantillon : une enzyme ayant une activité ADN polymérase dépendant de l'ARN, une enzyme ayant une activité ADN polymérase dépendant de l'ADN, une enzyme ayant une activité H ribonucléase, une enzyme ayant une activité ARN polymérase ; et à maintenir le mélange de réaction ainsi créé dans des conditions adéquates et pendant une durée suffisante pour que l'amplification puisse avoir lieu.