METHOD FOR DETECTING A NEW TYPE CORONAVIRUS INFECTION AGENT GENOME (NCOV19) IN PRIMATES

• Main Authors: Bannov Vasilij Aleksandrovich, Gulyukin Mikhail Ivanovich, Koshchaev Andrej Georgievich, Lysenko Aleksandr Anatolevich, Chernykh Oleg Yurevich, Malyshev Denis Vladislavovich, Krivonos Roman Anatolevich, Chernov Albert Nikolaevich
• Format: Patent
• Language: English; Russian
• Published: 11.01.2021
• Subjects: BEER; BIOCHEMISTRY; CHEMISTRY; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL ORENZYMOLOGICAL PROCESSES; ENZYMOLOGY; MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEICACIDS OR MICROORGANISMS; METALLURGY; MICROBIOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; SPIRITS; VINEGAR; WINE

FIELD: veterinary virology.SUBSTANCE: described is a method for detecting a genome of an agent of a new type of coronavirus infection (nCoV19). Method involves RNA extraction from biological material by choice: nasal, throat, nasopharyngeal swabs, nasopharyngeal aspirates, nasal washouts, sputum, bronchoalveolar lavage, sectional material, culture fluid samples, faecal extracts, fragments of abdominal organs taken from animals infected with coronavirus infection agent by sorption method. Further, cDNA synthesis on the RNA matrix by setup of single-step with the addition of internal and positive controls samples of the multiplex reverse transcription reaction and polymerase chain reaction - with 45 amplification cycles with real-time detection using oligonucleotide primers specific for the viral pathogen genome region, fluorescently labeled probe and control samples: an internal control sample in the form of a bacteriophage MS2 suspension with concentration of 5×103copies of nucleotide sequences per 1 mcl and a positive control sample in the form of a mixture of recombinant plasmid DNA containing a fragment of the coronavirus infection pathogen genome and a fragment of the bacteriophage MS2 genome taken in ratio 1:1. Then measuring the accumulation of the fluorescent signal through the channel for the specific signal and the Cy5/Red channel for the internal control signal and interpreting the results based on the presence or absence of the intersection of the fluorescence curve with the threshold line - Threshold, if the curves of the fluorescent signal accumulation go out before 35th cycle, then the reaction result is considered to be positive, and if curves do not cross threshold line or cross it after 35 cycle, result of reaction is negative. According to the invention, the biological material is taken from primates infected with a novel coronavirus infection agent nCoV19, and for the positive control sample, a mixture of recombinant plasmid DNA containing a fragment of the genome of the coronavirus infection agent of the new type nCoV19 and a fragment of the bacteriophage MS2 genome with the following nucleotide sequences: nCoV19-F 5'- GGAACTTCTCCTGCTAGA -3' - forward primer; nCoV19-R 5' - GCTGGTTCAATCTGTCAA -3' - reverse primer; nCoV19-P 5' -ROX- AAGCAAGAGCAGCATCACCGC -3' -BHQ2 - probe; MS2F, 5'-TGGCACTACCCCTCTCCGTATTCAC-3' - forward primer; MS2R, 5'-GTACGGGCGACCCCACGATGAC-3' - reverse primer; MS2P, Cy5 5'-CACATCGATAGATCAAGGTGCCTACAAGC-3'-BHQ2- probe. For a specific signal, the accumulation of the fluorescent signal is measured through a ROX/Orange channel. Invention extends the range of means of diagnosing coronavirus infection in primates, both in practice of veterinary service, and for scientific research.EFFECT: invention extends functional capabilities and provides reliable diagnosis of new-type coronavirus infection (nCov19) in primates, in a method for detecting a genome of a coronavirus infection agent of a new type (nCov19) in primates.1 cl, 4 tbl, 1 ex Изобретение относится к ветеринарной вирусологии. Описан способ выявления генома возбудителя коронавирусной инфекции нового типа (nCoV19). Способ включает выделение РНК из биологического материала по выбору: мазки из носа, горла, носоглотки, носоглоточные аспираты, назальные смывы, мокроту, бронхоальвеолярный лаваж, секционный материал, образцы культуральной жидкости, экстракты фекалий, фрагменты органов брюшной полости, взятый от животных, инфицированных возбудителем коронавирусной инфекции сорбционным методом. Далее синтез кДНК на матрице РНК путем постановки одноэтапной с добавлением внутреннего и положительного контролей образцов мультиплексной реакции обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции - с проведением 45 циклов амплификации с детекцией в реальном времени с использованием специфичных для участка генома вирусного возбудителя олигонуклеотидных праймеров, флуоресцентно-меченного зонда и контрольных образцов: внутреннего контрольного образца в виде суспензии бактериофага MS2 с концентрацией 5×103копий нуклеотидных последовательностей на 1 мкл и положительного контрольного образца в виде смеси рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих фрагмент генома возбудителя коронавирусной инфекции и фрагмент генома бактериофага MS2, взятых в соотношении 1:1. Потом измерение накопления флуоресцентного сигнала по каналу для специфического сигнала и каналу Cy5/Red для сигнала внутреннего контроля и интерпретацию результатов на основании наличия или отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией - Threshold, если кривые накопления флуоресцентного сигнала выходят до 35 цикла, то результат реакции считают положительным, а если кривые не пересекают пороговую линию или пересекают ее после 35 цикла, то результат реакции - отрицательный. Согласно изобретению биологический материал берут у приматов, инфицированных возбудителем коронавирусной инфекции нового типа nCoV19, а для положительного контрольного образца используют смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих фрагмент генома возбудителя коронавирусной инфекции нового типа nCoV19 и фрагмент генома бактериофага MS2 со следующими нуклеотидными последовательностями:nCoV19-F 5'- GGAACTTCTCCTGCTAGA -3' - прямой праймерnCoV19-R 5' - GCTGGTTCAATCTGTCAA -3' - обратный праймерnCoV19-Р 5' -ROX- AAGCAAGAGCAGCATCACCGC -3' -BHQ2 - зондMS2F, 5'-TGGCACTACCCCTCTCCGTATTCAC-3' - прямой праймерMS2R, 5'-GTACGGGCGACCCCACGATGAC-3' - обратный праймерMS2P, Cy5 5'-CACATCGATAGATCAAGGTGCCTACAAGC-3'-BHQ2-зонд. Для специфического сигнала накопление флуоресцентного сигнала измеряют по каналу ROX/Orange. Изобретение расширяет арсенал средств диагностики коронавирусной инфекции у приматов, как в практике ветеринарной службы, так и для научных исследований. Изобретение расширяет функциональные возможности и получение достоверной диагностики коронавирусной инфекции нового типа (nCovl9) у приматов, в способе выявления генома возбудителя коронавирусной инфекции нового типа (nCovl9) у приматов. 4 табл., 1 пр.