Protease activity determination in biological samples and liquid test sample, e.g. blood sample and blood serum, involves withdrawing protease from test sample of protease inhibitor by bringing test sample in contact with support material

• Main Authors: MEIER, HANS JOERG, HOFER, HANS WERNER
• Format: Patent
• Language: English; German
• Published: 02.04.2009
• Subjects: BEER; BIOCHEMISTRY; CHEMISTRY; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL ORENZYMOLOGICAL PROCESSES; ENZYMOLOGY; INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIRCHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES; MEASURING; MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEICACIDS OR MICROORGANISMS; METALLURGY; MICROBIOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; PHYSICS; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; SPIRITS; TESTING; VINEGAR; WINE

Protease activity determination involves withdrawing the protease from the test sample of the protease inhibitor by bringing the test sample in contact with a support material. An inhibitor-binding substance linked to the support material covalently or by adsorption, has high affinity or bond strength for the protease inhibitor than the protease. The support material bounded with the protease inhibitor is separated and a substrate for the protease, whose activity is to be determined, is added. The proteolytic reaction of the substrate takes place by the protease. Independent claims are included for: (1) a device for determining the activity of enzymes, particularly for executing the procedure for determining activity of protease in a liquid test sample, which comprises an equipment, e.g. a chromatography column, for withdrawing the inhibitor, where the equipment contains a support material and a substance bound to the support material; and (2) a kit for executing the procedure for determining activity of enzymes and protease in a liquid test sample, which has 7-amino-4-trifluoromethyl coumarin (AFC) substrate in pure form or dissolved in a measuring buffer, solid AFC as calibration substance, support material with papain, which is bounded covalently or by adsorption, and specific, synthetic inhibitor, e.g. E64 inhibitor for cysteine proteases or CA074 inhibitor cahepsin B. Es werden ein Verfahren und Vorrichtungen zur Bestimmung des Gesamtgehalts von Proteasen mit Hilfe der Messung ihrer Enzymaktivität nach vorheriger Deinhibierung offenbart. Lysosomale Proteasen sind in biologischen Proben ganz (z. B. im Blutserum) oder teilweise (z. B. in Gewebehomogenaten) inhibiert. Zur Deinhibierung wird ein Verfahren vorgeschlagen, bei dem man ein festes Trägermaterial (z. B. Nylon oder Nitrocellulose) als Kunststoffstreifen in die Messprobe eintaucht, an dem eine Inhibitorbindesubstanz kovalent oder adsorptiv gebunden ist, die den der Protease korrespondierenden Inhibitor stärker bindet als die Protease. Nach erfolgter Deinhibierung wird der Kunststoffstreifen aus der flüssigen Messprobe entfernt und die Messprobe der Enzymaktivitätsmessung zugeführt. Als besonders vorteilhaft für die Aktivitätsmessung erweisen sich fluorogene Substrate, aus denen das Fluorogen 7-Amino-4-Trifluormethylcumarin abgespalten wird. Diese Substrate ermöglichen gegenüber den herkömmlichen AMC-Substraten im Blutserum bei der Messung in Mikrotiterplatten mit dem Fluoreszenzreader eine mindestens 10fach höhere Empfindlichkeit und damit bei dieser Messanordnung, die breite Anwendung im klinischen Labor findet eine effektive fluorimetrische Bestimmung solcher Enzymaktivitäten im Blutserum.