método para a amplificação com base em transcrição de uma seqüência de ácido nucléico do hbv de filamento duplo alvo partindo do dna do hbv opcionalmente presente em uma amostra, oligonucleotídeo, e, conjunto de teste adequado para realizar a amplificação e detecção com base em transcrição de dna do hbv

• Main Authors: Arnoldina Margaretha Wilhelmina Strijp, Birgit Alberta Louisa Maria Deiman, Inge Marjolein Frantzen
• Format: Patent
• Language: Portuguese
• Published: 25.09.2018
• Subjects: BEER; BIOCHEMISTRY; CHEMISTRY; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; COMPOSITIONS THEREOF; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL ORENZYMOLOGICAL PROCESSES; CULTURE MEDIA; ENZYMOLOGY; INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIRCHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES; MEASURING; MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEICACIDS OR MICROORGANISMS; METALLURGY; MICROBIOLOGY; MICROORGANISMS OR ENZYMES; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; PHYSICS; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; PROPAGATING, PRESERVING OR MAINTAINING MICROORGANISMS; SPIRITS; TESTING; VINEGAR; WINE

"método para a amplificação com base em transcrição de uma seqüência de ácido nucléico do hbv alvo partindo do dna do hbv opcionalmente presente em uma amostra, oligonucleotídeo, conjunto de iniciadores de oligonucleotídeo adequados para o uso na amplificação de ácido nucléico do hbv, e, conjunto de teste adequado para realizar a amplificação e detecção com base em transcrição de dna do hbv". a presente invenção fornece um método para uma amplificação com base em transcrição de uma seqüência de ácido nucléico de hbv alvo partindo do dna de hbv opcionalmente presente em uma amostra, que compreende as etapas de, - incubar a amostra suspeita de conter hbv, em um tampão de amplificação com uma ou mais enzimas de restrição capazes de clivar o dna do hbv em um sítio de restrição selecionado, a dita enzima de restrição criando uma extremidade 3 definida do(s) dito(s) filamento(s) de dna do hbv, um iniciador promotor, o dito iniciador promotor tendo uma região 5 que compreende a seqüência de um promotor reconhecido por uma rna polimerase dependente de dna e uma região 3 complementar à extremidade 3 definida do filamento de dna, um iniciador segundo ou reverso, tendo a polaridade oposta do iniciador promotor e que compreende a extremidade 5 da dita seqüência alvo, e no caso de ssdna do hbv como a seqüência alvo, um iniciador de restrição, - manter a mistura de reação assim criada sob as condições apropriadas durante uma quantidade suficiente de tempo para que uma digestão pela enzima de restrição ocorra, submeter a amostra assim obtida a um tratamento térmico a uma temperatura e tempo suficientes para inativar a enzima de restrição e/ou para tornar pelo menos parcialmente um filamento duplo em filamento único, - adicionar os seguintes reagentes à amostra: uma enzima tendo atividade de dna polimerase dependente de rna, uma enzima tendo atividade de dna polimerase dependente de dna, uma enzima tendo atividade de rnase h, uma enzima tendo atividade de rna polimerase e - manter a mistura de reação assim criada sob as condições apropriadas durante uma quantidade suficiente de tempo para que a amplificação ocorra. The present invention provides a method for the transcription based amplification of a target HBV nucleic acid sequence starting from HBV DNA optionally present in a sample, comprising the steps of,-incubating the sample, suspected to contain HBV, in an amplification buffer with one or more restriction enzymes capable of cleaving the HBV DNA at a selected restriction site, said restriction enzyme creating a defined 3' end of the said HBV DNA strand(s), a promotor-primer, said promotor-primer having a 5' region comprising the sequence of a promotor recognized by a DNA-dependent RNA polymerase and a 3' region complementary to the define 3' end of the DNA strand, a second or reverse primer, having the opposite polarity of the promotor-primer and comprising the 5' end of the said target sequence, and in case of HBV ssDNA as the target sequence, a restriction primer,-maintaining the thus created reaction mixture under the appropriate conditions for a sufficient amount of time for a digestion by the restriction enzyme to take place,-subjecting the sample thus obtained to a heat treatment at a temperature and time sufficient to inactivate the restriction enzyme and/or to render at least partially a double strand single stranded,-adding the following reagents to the sample: an enzyme having RNA dependent DNA polymerase activity, an enzyme having DNA dependent DNA polymerase activity, an enzyme having Rnase H activity, an enzyme having RNA polymerase activity, and-maintaining the thus created reaction mixture under the appropriate conditions to a sufficient amount of time for the amplification to take place.