猫冠状病毒核衣壳蛋白的可溶性表达与多克隆抗体反应性鉴定

• Published in: 浙江大学学报（农业与生命科学版） Vol. 49; no. 3; pp. 424 - 434
• Main Authors: 张丹, 卢舒婷, 卢辰赫, 王子仪, 徐丽华, 陈伊玄, 王圣文, 金子安, 倪成章, 周继勇, 郑肖娟
• Format: Journal Article
• Language: Chinese
• Published: 浙江大学动物医学中心,农业农村部动物病毒学重点实验室,浙江 杭州 310058%浙江大学动物医学中心,农业农村部动物病毒学重点实验室,浙江 杭州 310058 01.06.2023; 浙江省农业科学院畜牧兽医研究所,浙江 杭州310021%浙江大学动物医学中心,农业农村部动物病毒学重点实验室,浙江 杭州 310058; 浙江大学海南研究院,海南 三亚 572025
• Subjects: 可溶性表达; 猫冠状病毒; 核衣壳蛋白; 多克隆抗体; 交叉反应性
• ISSN: 1008-9209
• DOI: 10.3785/j.issn.1008-9209.2021.05.072

S855.3; 为制备猫冠状病毒(feline coronavirus,FCoV)核衣壳(nucleocapsid,N)蛋白的特异性抗体,本研究将Ⅰ型FCoV(ZJU1709)的N蛋白基因全长cDNA亚克隆到pCold TF原核表达载体上,通过低温诱导表达、镍柱亲和纯化获得可溶性重组N蛋白;进一步以纯化的重组N蛋白为免疫原制备兔多克隆抗血清(多抗血清),再通过酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)、蛋白质印迹法(Western blotting,WB)、间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescence assay,IFA)等多种方法对兔多抗血清进行反应性鉴定.结果显示:经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)和低温诱导,成功表达出分子量约为100 kDa的可溶性重组N蛋白,在非变性条件下亲和纯化获得的重组N蛋白质量浓度达到1.4 mg/mL;N蛋白兔多抗血清的ELISA效价可达1×106,与真核表达的重组蛋白Flag-N以及FCoV感染细胞中的N蛋白均具有良好的WB和IFA反应性.交叉反应性结果显示:该多克隆抗体能与α属冠状病毒中不同亚型的FCoV以及犬冠状病毒(canine coronavirus,CCoV)、猪传染性胃肠炎病毒(porcine transmissible gastroenteritis virus,TGEV)、猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的N蛋白发生反应,但不与β属冠状病毒中的严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome-related coronavirus 2,SARS-CoV-2)和γ属冠状病毒中的传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV)的N蛋白发生反应.综上所述,以pCold TF原核系统表达的可溶性重组N蛋白具有良好的免疫原性,以该蛋白制备的FCoV N蛋白兔多抗血清能识别多种来自不同物种的α属冠状病毒N蛋白,但与β、γ属冠状病毒N蛋白没有交叉反应性,这为进一步研究FCoV复制机制以及开发高效的抗原和抗体检测技术奠定了基础.