miR-185-5p通过抑制巨噬细胞自噬促进胞内分枝杆菌生长

R378.91; 目的·探究miR-185-5p在分枝杆菌感染的巨噬细胞中对自噬的调控作用和对胞内分枝杆菌生存的影响.方法·使用卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin,BCG)感染人单核细胞白血病细胞(THP-1)诱导分化的巨噬细胞,通过超速离心法分离细胞培养上清液中的外泌体;通过Western blotting、纳米颗粒跟踪分析(nanoparticle tracking analysis,NTA)、透射电子显微镜(transmission electron microscopy,TEM)分别对外泌体的表面标志蛋白、大小和形态进行鉴定,通过实时荧光定量PCR(quantit...

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Published in上海交通大学学报（医学版） Vol. 43; no. 6; pp. 699 - 708
Main Authors 吴淇琦, 汪豪, 林砺, 晏博, 张舒林
Format Journal Article
LanguageChinese
Published 上海交通大学医学院免疫学与微生物学系,上海 200025%武汉轻工大学生命科学与技术学院,武汉 430023%复旦大学附属公共卫生临床中心,上海 201508%上海交通大学医学院免疫学与微生物学系,上海 200025 01.06.2023
复旦大学附属公共卫生临床中心,上海 201508
Subjects
Mycobacterium infection
自噬
autophagy
外泌体
分枝杆菌感染
巨噬细胞
macrophage
miR-185-5p
exosome
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ISSN1674-8115
DOI10.3969/j.issn.1674-8115.2023.06.006

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Summary:R378.91; 目的·探究miR-185-5p在分枝杆菌感染的巨噬细胞中对自噬的调控作用和对胞内分枝杆菌生存的影响.方法·使用卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin,BCG)感染人单核细胞白血病细胞(THP-1)诱导分化的巨噬细胞,通过超速离心法分离细胞培养上清液中的外泌体;通过Western blotting、纳米颗粒跟踪分析(nanoparticle tracking analysis,NTA)、透射电子显微镜(transmission electron microscopy,TEM)分别对外泌体的表面标志蛋白、大小和形态进行鉴定,通过实时荧光定量PCR(quantitative polymerase chain reaction,qPCR)检测BCG感染的巨噬细胞内及外泌体中miR-185-5p的表达水平.外泌体使用PKH26染料进行荧光染色并与巨噬细胞共培养,观察巨噬细胞对外泌体的吞噬情况.通过模拟物(mimic)和抑制剂(inhibitor)实现miR-185-5p在巨噬细胞内的过表达和抑制作用,通过菌落形成单位(colony-forming unit,CFU)实验验证miR-185-5p对巨噬细胞内BCG生长存活的影响.通过Western blotting检测自噬标志物微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)蛋白的表达,研究过表达、抑制miR-185-5p以及使用自噬抑制剂氯喹(chloroquine,CQ)对巨噬细胞自噬的影响;进一步使用SensGFP-StubRFP-LC3自噬双荧光慢病毒检测miR-185-5p对自噬流的影响.使用TargetScan、miRDB和Starbase数据库对miR-185-5p的靶基因进行预测,并使用注释、可视化和综合发现数据库(Database for Annotation,Visualization and Integrated Discovery,DAVID)工具进行基因本体(Gene Ontology,GO)分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)功能富集分析.结果·超速离心法成功分离出巨噬细胞外泌体,Western blotting成功检测到外泌体标志蛋白白细胞分化抗原9(
ISSN:1674-8115
DOI:10.3969/j.issn.1674-8115.2023.06.006