利用Crispr/Cas9基因编辑系统在人胚胎干细胞中探索ELABELA的潜在新受体

• Published in: 上海交通大学学报（医学版） Vol. 42; no. 9; pp. 1258 - 1264
• Main Authors: 周月, 程晨, 郑恩霖, 孟卓, 王鉴, 王青洁, 何勇宁, 孙锟
• Format: Journal Article
• Language: Chinese
• Published: 上海交通大学医学院附属新华医院小儿心血管科,上海200092%上海交通大学医学院附属仁济医院上海肿瘤研究所,上海200127 01.09.2022
• Subjects: 人胚胎干细胞; 基因编辑; ELABELA; APJ
• ISSN: 1674-8115
• DOI: 10.3969/j.issn.1674-8115.2022.09.012

R394.2; 目的·利用Crispr/Cas9基因编辑技术在人胚胎干细胞(human embryonic stem cell,hESC)中探索小分子多肽ELABELA(ELA)是否存在潜在的新受体.方法·收集干细胞向心肌细胞定向分化过程中不同天数(0～13d)的细胞,检测其ELA及其受体APJ的动态表达水平.在干细胞向心肌细胞定向分化过程中加入APJ抑制剂ML221,观察心肌细胞标志物MYH6、TnnT2及NKX2.5的mRNA表达水平是否发生变化.利用人胚肾悬浮细胞(HEK-293F)表达重组ELA绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP),研究ELA发挥结合作用的区域在其C末端还是N末端,构建GFP序列分别插入ELA-32序列的C末端及N末端的2种重组质粒.利用Crispr/Cas 9基因编辑技术构建ELA唯一已知受体APJ敲除的hESC并进行验证.在构建成功的敲除细胞系及正常细胞系中外源性加入2种GFP-ELA重组蛋白,通过荧光显微镜观察ELA是否能够进入细胞.结果·在干细胞向心肌细胞定向分化过程中,在干细胞时期,ELA高表达而APJ低表达;ELA表达高峰在分化第6天而APJ表达高峰出现在分化第3天.外源性加入APJ抑制剂ML221后,MYH6、TnnT2及NKX2.5的mRNA表达水平无显著变化(P＞0.05).经过基因DNA测序及Western blotting验证,成功构建敲除APJ干细胞系.敲除APJ后,外源性加入ELAN端荧光蛋白,仍能够进入细胞内;而ELAC端荧光蛋白未出现荧光,表示ELA C端荧光蛋白不能进入细胞.结论·hESC中存在非APJ的ELA其他受体,ELA与受体发生结合的部位主要位于C末端.