一种快速添加或替换蛋白标签的新方法及应用

S661.2; [目的]本文旨在建立一种快速添加或替换蛋白标签的新方法——多标签重组连接酶法,为进一步研究目的基因的功能奠定基础.[方法]利用同源重组连接酶反应,将目的基因、蛋白标签和酶切的表达载体同时进行连接,建立一种快速添加或替换目的基因蛋白标签的新方法.[结果]多标签重组连接酶法在用时和步骤上比融合PCR法和T4 DNA连接酶法具有一定的优势.以梨S7-RNase为目的基因,基于同源重组连接酶反应,成功将S7-RNase和GFP蛋白标签构建到pCold-TF载体上,并在15℃和IPTG终浓度为0.5 mmol?L-1时,对重组质粒S7-RNase-GFP-pCold-TF进行原核表达并成...

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Published in南京农业大学学报 Vol. 44; no. 6; pp. 1046 - 1053
Main Authors 张皓, 刘雪莹, 钱铭, 高鸿儒, 汤超, 张华, 王鹏, 张绍铃, 吴巨友
Format Journal Article
LanguageChinese
Published 南京农业大学园艺学院/江苏省梨工程研究中心,江苏 南京210095%上海农林职业技术学院,上海201699 2021
Subjects
目的基因;蛋白标签;重组酶;添加;替换
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ISSN1000-2030
DOI10.7685/jnau.202012014

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Summary:S661.2; [目的]本文旨在建立一种快速添加或替换蛋白标签的新方法——多标签重组连接酶法,为进一步研究目的基因的功能奠定基础.[方法]利用同源重组连接酶反应,将目的基因、蛋白标签和酶切的表达载体同时进行连接,建立一种快速添加或替换目的基因蛋白标签的新方法.[结果]多标签重组连接酶法在用时和步骤上比融合PCR法和T4 DNA连接酶法具有一定的优势.以梨S7-RNase为目的基因,基于同源重组连接酶反应,成功将S7-RNase和GFP蛋白标签构建到pCold-TF载体上,并在15℃和IPTG终浓度为0.5 mmol?L-1时,对重组质粒S7-RNase-GFP-pCold-TF进行原核表达并成功表达出了重组蛋白.同时,将p1300-35S-GFP载体中的GFP蛋白标签成功替换为mCherry蛋白标签,并将重组质粒p1300-35S-S7-RNase-mCherry在烟草细胞中成功表达.[结论]多标签重组连接酶法具有快速、简单和高效等特点,并且适用于构建多个蛋白标签或替换某个蛋白标签的表达载体,是一种可靠的高效获得目的基因所需蛋白标签的新方法.
ISSN:1000-2030
DOI:10.7685/jnau.202012014