利用胞嘧啶碱基编辑器高效制备奶牛BLG基因敲除胚胎的研究

S852.6; [目的]β-乳球蛋白是由BLG基因编码的蛋白质,是牛乳中主要的过敏原.本试验旨在使用优化后的单碱基编辑器(CBE)YE1-BE3-FNLS和YE1-AncBE4max对牛胚胎BLG基因进行单碱基编辑,同时对2种单碱基编辑器在牛胚胎BLG基因敲除效果进行评价.[方法]在奶牛的BLG基因的第一外显子上设计sgRNA序列,通过胞嘧啶碱基编辑器将BLG基因第21位密码子CAG突变为TAG,实现c*.61C＞T(p.Q21*)的转变,获得终止密码子,使蛋白质翻译提前终止,达到基因敲除的目的.通过体外转录获得sgRNA以及YE1-BE3-FNLS和YE1-AncBE4max的mRNA,显微...

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Published in南京农业大学学报 Vol. 47; no. 6; pp. 1159 - 1167
Main Authors 丁修虎, 丁强, 王悦, 夏淑雯, 赵芳, 陈坤琳, 吴家顺, 何南, 仲跻峰, 王慧利, 李惠侠
Format Journal Article
LanguageChinese
Published 江苏省农业科学院畜牧研究所/江苏省畜禽精准育种工程研究中心/农业农村部种养结合重点实验室,江苏南京 210014%江苏省农业科学院畜牧研究所/江苏省畜禽精准育种工程研究中心/农业农村部种养结合重点实验室,江苏南京 210014%山东农业大学动物科技学院,山东泰安 271018%南京农业大学动物科技学院,江苏南京 210095 2024
南京农业大学动物科技学院,江苏南京 210095
Subjects
BLG基因
dairy cow
胚胎
embryo
单碱基编辑
cytosine base editor
BLG gene
奶牛
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ISSN1000-2030
DOI10.7685/jnau.202309010

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Summary:S852.6; [目的]β-乳球蛋白是由BLG基因编码的蛋白质,是牛乳中主要的过敏原.本试验旨在使用优化后的单碱基编辑器(CBE)YE1-BE3-FNLS和YE1-AncBE4max对牛胚胎BLG基因进行单碱基编辑,同时对2种单碱基编辑器在牛胚胎BLG基因敲除效果进行评价.[方法]在奶牛的BLG基因的第一外显子上设计sgRNA序列,通过胞嘧啶碱基编辑器将BLG基因第21位密码子CAG突变为TAG,实现c*.61C＞T(p.Q21*)的转变,获得终止密码子,使蛋白质翻译提前终止,达到基因敲除的目的.通过体外转录获得sgRNA以及YE1-BE3-FNLS和YE1-AncBE4max的mRNA,显微注射到奶牛胚胎中,收集囊胚,分别检测20枚YE1-BE3-FNLS编辑囊胚和24枚YE1-AncBE4max编辑囊胚,进行胚胎基因组PCR扩增,扩增BLG基因目标序列并进行测序验证编辑效率.根据sgRNA的序列,全基因组选择错配碱基最少的5个潜在脱靶位点进行脱靶检测.[结果]囊胚靶向编辑效率检测结果表明,YE1-AncBE4max对牛胚胎BLG基因的靶向编辑效率为83.3％(20/24)高于YE1-BE3-FNLS的靶向编辑效率60％(12/20),而前者存在较大的编辑窗口(C1-C9),可对sgRNA序列上的多个胞嘧啶进行编辑,后者具有较小的编辑窗口 C2-C4;另外,YE1-BE3-FNLS具有较高的靶位点双链编辑效率35％(7/20),而YE1-AncBE4max只有2枚编辑胚胎发生双链编辑,纯合编辑率较低;2种单碱基编辑器制备的编辑胚胎均未出现插入缺失和脱靶效应.[结论]本文使用的2种胞嘧啶碱基编辑器均能高效制备奶牛BLG基因编辑胚胎,为进一步获得BLG基因单碱基敲除奶牛储备技术方法.
ISSN:1000-2030
DOI:10.7685/jnau.202309010