日本沼虾Bax基因克隆及其在低氧胁迫过程中的作用

Q785%S966.12; 为探究细胞凋亡相关基因Bax(B-cell lymphoma-2 associated X protein)在日本沼虾低氧胁迫过程中所发挥的作用,实验采用cDNA末端快速扩增(RACE)PCR技术获得日本沼虾细胞凋亡相关基因Bax的cDNA全长序列,采用半定量RT-PCR与实时荧光定量PCR(qPCR)分析其在日本沼虾不同组织、不同低氧阶段的表达情况,同时采用Western blot与免疫组化分析了低氧下日本沼虾Bax蛋白的表达与定位.日本沼虾Bax基因cDNA全长2 287 bp(NCBI 登录号:MZ823353),包括 5'非编码区(UTR)为 42...

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Published in水产学报 Vol. 48; no. 8; pp. 65 - 78
Main Authors 赵倩倩, 孙西超, 郑诚, 薛程, 孙盛明
Format Journal Article
LanguageChinese
Published 上海海洋大学,农业农村部淡水水产种质资源重点实验室,上海 201306%上海海洋大学,农业农村部淡水水产种质资源重点实验室,上海 201306 01.08.2024
上海海洋大学,水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室,上海 201306
Subjects
细胞凋亡
低氧
hypoxic
原核表达
Bax
apoptosis
日本沼虾
Macrobrachium nipponense
prokaryotic expression
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ISSN1000-0615
DOI10.11964/jfc.20220513497

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Summary:Q785%S966.12; 为探究细胞凋亡相关基因Bax(B-cell lymphoma-2 associated X protein)在日本沼虾低氧胁迫过程中所发挥的作用,实验采用cDNA末端快速扩增(RACE)PCR技术获得日本沼虾细胞凋亡相关基因Bax的cDNA全长序列,采用半定量RT-PCR与实时荧光定量PCR(qPCR)分析其在日本沼虾不同组织、不同低氧阶段的表达情况,同时采用Western blot与免疫组化分析了低氧下日本沼虾Bax蛋白的表达与定位.日本沼虾Bax基因cDNA全长2 287 bp(NCBI 登录号:MZ823353),包括 5'非编码区(UTR)为 42 bp,3'UTR 为 814 bp,开放阅读框(ORF)1 431 bp,编码476个氨基酸.通过软件和生物信息网站对其序列进行分析,氨基酸相似度比对显示,日本沼虾细胞凋亡基因Bax富含高度保守的BH1、BH2及BH3结构域.系统进化树分析显示,日本沼虾Bax基因与斑节对虾等甲壳动物Bax聚为一支,具有最近的亲缘关系.RT-PCR结果表明,日本沼虾Bax基因在肝胰腺中表达量最高,在脑中表达量最低.在低氧胁迫1～96h时,日本沼虾鳃和肝胰腺组织Bax基因表达量均显著高于对照组,这与日本沼虾Bax蛋白表达丰度基本相似.通过构建原核表达载体获得体外重组蛋白Bax,并将纯化重组蛋白免疫兔子获得抗血清.免疫组化结果显示,鳃和肝胰腺Bax蛋白阳性信号主要定位在鳃上皮细胞和肝细胞中.最后,采用流式细胞仪分析表明,日本沼虾血细胞凋亡率在低氧胁迫96h时显著高于对照组,这与日本沼虾Bax基因转录水平和蛋白表达丰度相吻合.研究表明,日本沼虾Bax基因在日本沼虾不同组织应答低氧胁迫分子过程中均具有促凋亡作用.本研究可为探明日本沼虾不耐低氧的分子机制提供理论参考.
ISSN:1000-0615
DOI:10.11964/jfc.20220513497