リボゾームDNA 遺伝子を標的としたLightCycler™リアルタイムPCR ・融解温度分析法を用いた臨床分離真菌株の鑑別と同定－Scedosporium 属に着目して

• Published in: 天理医学紀要 Vol. 22; no. 2; pp. 71 - 78
• Main Authors: 松谷, 日路子, 松尾, 収二, 小松, 方, 福田, 砂織, 松本, 学, 大野, 裕貴, 嶋田, 昌司, 阿部, 教行, 川, 明希
• Format: Journal Article
• Language: English; Japanese
• Published: 公益財団法人 天理よろづ相談所 医学研究所 25.12.2019
• Subjects: LightCycler™リアルタイムPCR; Scedosporium 属; リボゾームDNA 遺伝子; 糸状真菌と酵母様真菌; 融解温度(Tm) 分析
• ISSN: 1344-1817; 2187-2244
• DOI: 10.12936/tenrikiyo.22-016

今回我々は，真菌リボゾームDNA 遺伝子のinternal transcribed spacer 2 (ITS2)とD1/D2 の2 つの領域を標的としたLightCycler™リアルタイムPCR・融解温度(Tm) 分析法を開発し，本法を，Scedosporium 属を含む臨床分離真菌株の鑑別と同定に応用した．菌株は2008 年8 月から2016 年7 月までの間に当院で分離された糸状真菌5 菌種と酵母様真菌8 菌種を対象とした。LightCycler™ 2.0 を用いてITS2 とD1/D2 のPCR 産物のT m 値を求め，2 つのT m 値の組み合わせから分離株を鑑別・同定した．S. prolificans 3 株のITS2 とD1 / D2 領域のPCR 産物のTm 値（平均値±標準偏差[SD]）は，それぞれ89.6 ± 0.20 °C と89.9 ± 0.07 °C，S. apiospermum 1 株のTm 値は，それぞれ91.0 °C と91.7 °C で，2 菌種を鑑別することができた．Scedosporium 属のT m 値はAspergillus 属のそれよりも低く，これらの2 つの糸状真菌の鑑別も可能であった．酵母様真菌では，8 菌種中7 菌種で特異的なTm 値プロフィルを示した．例外的に，Candida krusei はS. apiospermum に類似のTm 値プロフィルを示した．従って，検討した13 菌種中9 菌種の鑑別・同定が可能であった．ATCC 株を用いた検出感度は，C. albicans ではITS2，D1/D2 とも1 × 104 CFU/mL，A. fumigatus ではITS2 が1 × 105 CFU/mL，D1/D2 が1 × 102 CFU/mL であった． 測定を10 回繰り返しT m 値の再現性を確認したところ，ITS2 とD1 / D2 領域のSD は，それぞれ± 0.04 –0.21 °Cと± 0.02–0.05 °C であった．今回開発したLightCycler™リアルタイムPCR・Tm 分析法は，臨床分離真菌の鑑別・同定に関する迅速かつ信頼性の高い情報を提供し，有効な抗真菌治療を早期に開始するうえで価値が高い．