ラット切歯におけるamelogenin遺伝子の発現に関する電顕的観察

amelogeninはエナメル質有機質の約90%を占めるエナメルタンパクである. ameloggeninの遺伝子発現はin situ hybridization(ISH)を用いて多く行われているが, 光顕を用いたISHでは, 内エナメル上皮などにamelogenin mRNAを検出することが困難であった. そこで電顕を用いてamelogenin mRNAの局在観察し, amelogeninタンパクの電顕的局在とを比較検討を行った. 【材料と方法】材料には体重約40gのWistar系ラットとDDY系マウスを用いた. 動物をDEPC waterを使用して作製した0.025 M phosphate...

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Published in歯科基礎医学会雑誌 Vol. 41; no. 5; p. 415
Main Authors 稲毛稔彦, 堀部崇大, 中田智子, 桑田文幸, 下川仁弥太
Format Journal Article
LanguageJapanese
Published 歯科基礎医学会 30.08.1999
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Summary:amelogeninはエナメル質有機質の約90%を占めるエナメルタンパクである. ameloggeninの遺伝子発現はin situ hybridization(ISH)を用いて多く行われているが, 光顕を用いたISHでは, 内エナメル上皮などにamelogenin mRNAを検出することが困難であった. そこで電顕を用いてamelogenin mRNAの局在観察し, amelogeninタンパクの電顕的局在とを比較検討を行った. 【材料と方法】材料には体重約40gのWistar系ラットとDDY系マウスを用いた. 動物をDEPC waterを使用して作製した0.025 M phosphate buffer(pH7.4)で希釈した1%glutaraldehydeを含む4% paraformaldehyde液で左心室より灌流固定を行った. 上顎切歯を0.1 M EDTAで脱灰し, 切歯が矢状断される方向にVibratomeで約100μmの切片とした. probeはBluescript SK+に挿入したマウスamelogenin cDNA439bpを使用した. antisenese-RNAを作製するためにはXho Iで切断後, Digoxigenine(Dig)存在下でT3 RNA polymeraseで転写を行いDig-labeled RNAを作製した. またsense-RNAを作製するためには, EcoRIで切断後同様にT7 RNA polymcraseで転写を行いDig-labeled RNAを作製した. Vibratomeで作製した切片を使用してhybridizationを行い, peroxidase-labeled抗Dig抗体で反応後, DAB反応を行い, Epon 812に包埋して超薄切片とした. 免疫反応では抗ウシamelogenin抗体を使用してProtein A gold法で反応を行った. 【結諭と考察】amelogenin mRNAの発現はcervical loop付近の内エナメル上皮や分泌期エナメル芽細胞に観察された. 遺伝子発現の局在は免疫組織化学の結果と一致していた. 電顕を用いたISHは遺伝子発現の感度が高く, amelogeninはcervical loop付近の内エナメル芽細胞によって合成されることが確認された.
ISSN:0385-0137