Nachweis eines essentiellen Einflusses des basischen Leuzinzippermotivs im Nichtstrukturprotein 4B des Hepatitis C Virus auf die Replikationseffizienz in einem Genotyp 1b-Replikonmodell
Einleitung: Der aminoterminale Teil des Nichtstrukturproteins 4B (NS4B) des Hepatitis C Virus (HCV) ist in die subzelluläre Proteinlokalisation und Ausbildung einer Alteration des Endoplasmatischen Retikulums involviert, die als Ort des viralen Replikationskomplexes gilt. Ein basischer Leuzinzipper...
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Published in | Zeitschrift für Gastroenterologie |
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Main Authors | , , , , , , |
Format | Conference Proceeding |
Language | German |
Published |
09.08.2011
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Summary: | Einleitung:
Der aminoterminale Teil des Nichtstrukturproteins 4B (NS4B) des Hepatitis C Virus (HCV) ist in die subzelluläre Proteinlokalisation und Ausbildung einer Alteration des Endoplasmatischen Retikulums involviert, die als Ort des viralen Replikationskomplexes gilt. Ein basischer Leuzinzipper (bZIP) ist ein repetitives Proteinbindungsmotiv, das Helix-bildend über hydrophobe Aminosäuren an den Positionen „a„ und „d„ eine nicht kovalente Bindung durch Formation eines hydrophoben Kerns zwischen Interaktionspartnern vermitteln kann. In vorherigen Arbeiten haben wir ein bZIP-Motiv im aminoterminalen Teil des HCV-NS4B identifiziert und eine ausschlaggebende Bedeutung für spezifische NS4B/NS4B-Interaktionen gezeigt.
Ziele:
Es sollte die Bedeutung des bZIP-Motivs für die virale Replikationseffizienz in einem HCV-Replikationsmodell untersucht werden.
Methodik:
Basierend auf einem Strukturmodell und einer
in-silico
Sequenzanalyse erfolgte eine Ziel-gerichtete Mutagenese. Für alle Experimente wurde das pFKI389neo/NS3–3'/ET-Plasmid, das auf einer subgenomischen HCV-Genotyp 1b-Replikationssequenz basiert, verwendet. Konservative und auch nicht konservative Mutationen wurden an den Positionen „a„ und „d„ als Einzel- und Doppelmutation eingeführt. Der korrekte Einbau wurde durch Sequenzierung bestätigt. Nach Transkription der RNA mittels T7 RNA-Polymerase, Linearisation und Reinigung des Plasmids erfolgte die Transfektion von Huh7-Lunet-Zellen. Zellen, die selbst-replizierende Replikonsequenzen enthielten, wurden über Selektion mit Geneticin identifiziert. Wild-typ- und defekte Replikonplasmide wurden als Positiv- und Negativkontrollen eingesetzt.
Ergebnis:
Insgesamt wurden 5 einzelne oder doppelte Mutationen eingeführt. Während eine konservative Mutation an Position „a„ zu keiner Veränderung der Replikationseffizient führte, zeigte sich eine starke Abnahme bis zu letalen Mutationen bei Einführung von nicht-konservativen Einzel- oder Doppelmutationen. Weiterhin wurden adaptive Mutationen beobachtet.
Schlussfolgerung:
Die vorliegende Studie zeigt eine Bedeutung des HCV-NS4B-bZIP-Motivs für die virale Replikation in einem etablierten Replikationsassay mit ausschlaggebender Bedeutung der Positionen „a„ und „d„. Zudem wurden neue adaptive Mutationen identifiziert. |
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ISSN: | 0044-2771 1439-7803 |
DOI: | 10.1055/s-0031-1285183 |