Beteiligung von Apurin/Apyrimidin-Endonuclease 1 und mitochondrialer ROS an der Entstehung neuronaler Schädigungen von C. elegans

• Published in: Diabetologie und Stoffwechsel
• Main Authors: Schlotterer, A, Kukudov, G, Pfeiffer, M, Bierhaus, A, Nawroth, P, Morcos, M
• Format: Conference Proceeding
• Language: German
• Published: 17.05.2010
• ISSN: 1861-9002; 1861-9010
• DOI: 10.1055/s-0030-1255200

Fragestellung: Bei Kultivierung von C. elegans unter erhöhter Glukose-Konzentration ist die Akkumulation von Deletionen mitochondrialer DNA (dmtDNA) signifikant verstärkt. Die Entstehung von dmtDNA ist mit der Bildung mitochondrialer reaktiver Sauerstoffspezies (mtROS) assoziiert und wird durch die Präsenz von Apurin/Apyrimidin (AP)-Stellen begünstigt. Die AP-Endonuclease APE1 ist das zentrale Enzym des mitochondrialen DNA-Reparatursystems von AP-Stellen und wird ortholog als exo-3 in C. elegans exprimiert. Ziel dieser Studie war es, den Einfluss von exo-3 und mtROS auf die gesamtzelluläre ROS-Bildung, das Auftreten morphologischer Veränderungen des Nervensystems, die Beeinträchtigung neuronaler Funktionen und die Lebensspanne zu untersuchen. Methodik: C. elegans wurden unter Standard- sowie erhöhten Glukose-Bedingungen kultiviert um Glukose-Konzentrationen von 6 bzw. 14mmol/l zu erreichen. Die Repression von exo-3 (R09B3.1) erfolgte durch Bakterien-vermittelte RNAi, die Reduktion der mtROS-Bildung durch Behandlung mit dem mitochondrialen Entkoppler FCCP. Die Expression von exo-3 mRNA und der Gehalt an mtDNA wurden durch quantitative real-time PCR gemessen. ROS-Bildung wurde mittels Hydoethidin-Färbung nachgewiesen und durch computergestützte Bildanalyse konfokaler Laser-Rastermikroskopie (CLSM) quantifiziert. Die strukturelle Integrität der Nervenbahnen und Kommissuren wurde in pan-neuronal YFP-überexprimierenden (NW1229) Tieren durch CLSM untersucht. Zur Bestimmung funktioneller neuronaler Schäden wurden die Bewegungsgeschwindigkeiten des Kopfes und des Körpers mittels computergestützter Videoanalyse (WormTracker 2.0.25) berechnet. Die Lebensspannen wurden durch Berechnung von Kaplan-Meier-Überlebenskurven analysiert und mittels ANOVA/Fisher's PLSD verglichen. Ergebnisse: Durch Steigerung des Glukose-Spiegels und durch Suppression von exo-3 wurde die Akkumulation von dmtDNA in 12-Tage alten C. elegans um 203% (P<0,05) bzw. 248% (P<0,05) gesteigert, die mittlere Lebensspanne von 18,5±0,4 auf 16,3±0,6 (P<0,01) bzw. 15,4±0,1 (P<0,01) Tage und die maximale Lebensspanne von 25,9±0,4 auf 22,9±0,2 (P<0,001) bzw. 23,2±0,1 (P<0,001) Tage verkürzt. Repression von exo-3 führte auch zum Anstieg der ROS-Bildung auf das 2-fache (P<0,01), strukturellen Veränderungen des Nervensystems sowie Reduktion der Bewegungsgeschwindigkeiten des Kopfes um 43% (P<0,01) und des Körpers um 38% (P<0,05). Reduktion von mtROS durch FCCP in exo-3-reprimierten Tieren verringerte die gesamtzelluläre ROS-Bildung, reduzierte neuronale Schäden, steigerte die Beweglichkeit und verlängerte die Lebensspanne. Schlussfolgerungen: Die Expression des APE1-Orthologs exo-3 und die Bildung von mtROS sind mit der Entstehung struktureller und funktioneller neuronaler Schädigungen sowie der Lebensspanne von C. elegans assoziiert. Diese Daten deuten auf eine pathogenetische Rolle des mitochondrialen DNA-Reparatursystems bei C. elegans hin.