Expression of recombinant escherichia coli l-asparaginase II, purification and characterization

• Published in: The Egyptian journal of biochemistry & molecular biology : EJB Vol. 29; no. 2; pp. 237 - 256
• Main Authors: Muhammad, Muhammad Raja, Sabri, Gilane Muhammad, Maharem, Tahany Mahmud, Muhammad, Manal Asim Imam
• Format: Journal Article
• Language: Arabic; English
• Published: Cairo, Egypt Egyptian Society of Biochemistry and Molecular Biology 21.11.2011
• Subjects: Asparaginase
• ISSN: 1687-1502; 2090-2603; 1687-1502
• DOI: 10.4314/ejbmb.v29i2.72437

-L-Asparaginase (ASNase) is an anti-cancer ("antineoplastic" or "cytotoxic") chemotherapy drug that is used for the treatment of acute lymphoblastic leukemia (ALL). An efficient and economical scheme was developed for over expression and rapid purification of the Escherichia coli enzyme. The gene encoding for the Escherichia coli L-asparaginase were PCR-amplified and cloned in pGEX-4Tl expression vector. The recombinant L-asparaginase was purified to homogeneity by affinity chromatography on glutathione Sepharose column. The recombinant enzyme had an apparent MW of 152 kDa and a Km value of 12.5 |iM for the main physiological substrate L-asparagine. The p / value was 5.6 while the turnover number (catalytic constant) was 1 x 102 s"1 and the Kca / Km value (specificity constant) was 0.8 x 107 M'V1. يلعب الأسبراجينيز دورا هاما في الحفاظ على الاتزان النيتروجيني و مستوى الأحماض الأمينية داخل الخلايا الطبيعية حيث إنه يحول الأسبراجين إلى حمض أسبارتك و نشادر كما أنه يعتبر دواء فعالا في علاج سرطان الدم حيث أنه يؤدي إلى اختفاء أسبراجين الدم فتحرم خلايا السرطان من هذا الحامض الأميني الأساسي و التي تعد عاجزة بدورها على تكوينه مما يترتب على ذلك هلاكها حيث تصبح غير قادرة على بناء البروتينات اللازمة لخلاياها. شملت الدراسة تحضير إنزيم الأسبراجينيز المهجن من بكتريا القولون باستخدام تفاعل البلمرة المتسلسل، تفاعلات القطع المزدوج و اللصق لجين الأسبراجينيز و الناقل البلازميدي المعبر و إنتاج بروتين أسبراجينيز -2 داخل بكتريا القولون ثم فصله و تنقيته باستخدام عمود جلوتاثيون سيفاروز. و قد تم دراسة بعض الخصائص الكيميائية الحيوية لإنزيم الأسبراجينيز مثل الوزن الجزيئي 152 كيلو دالتون، نقطة التعادل الكهرب 5,1، ثابت ميكائيل 12,5 ميكرومول للإنزيم، ثابت التحفيز 1×210 ثانية-1، و ثابت الاختصاص 0,8 × 610، مول-1 ثانية-1.