构建及鉴定携带角蛋白启动子和人乳头瘤病毒16 E6／E7基因的重组腺病毒

• Published in: Xi'an jiao tong da xue xue bao. Journal of Xi'an Jiaotong University (medical sciences). Yi xue ban Vol. 27; no. 5; pp. 421 - 425
• Main Author: 潘巍巍 赖国旗 易发平 成海恩 张溢 左国伟 李成华 马永平 宋方洲
• Format: Journal Article
• Language: Chinese
• Published: 重庆医科大学,重庆市生物化学与分子药理学重点实验室,重庆,400016%重庆医科大学,实验动物中心,重庆,400016%重庆医科大学,生物化学与分子生物学教研室,重庆,400016 2006; 重庆医科大学,重庆市生物化学与分子药理学重点实验室,重庆,400016; 重庆医科大学,教育部临床检验诊断学重点实验室,重庆,400016; 重庆医科大学,生物化学与分子生物学教研室,重庆,400016
• Subjects: 人乳头瘤病毒; 腺病毒; 角蛋白启动子; 角蛋白启动子; 人乳头瘤病毒; 腺病毒
• ISSN: 1671-8259
• DOI: 10.3969/j.issn.1671-8259.2006.05.002

目的利用AdEasy系统构建携带人角蛋白启动子的人乳头瘤病毒-16（HPV-16）E6／E7基因重组腺病毒，并通过RT-PCR方法检测E6／E7基因的表达。方法应用PCR方法从含有HPV-16全基因序列的质粒上扩增E6／E7基因，构建pCDNA3．1（-）-K14-E6／E7-polA载体，扩增、酶切获得K14-E6／E7-polA片段插入腺病毒穿梭载体质粒pAdT rack上，构建重组穿梭载体pAdT rack-K14-E6／E7-polA，线性化后与骨架载体AdEasy-1在细菌BJ5183内同源重组得到腺病毒质粒pAd-K14-E6／E7-polA，经人胚肾293细胞包装后得到重组腺病毒pAd-K14-E6／E7-polA。氢化铯（CsCI）梯度离心纯化病毒，提取病毒再感染后的293细胞总RNA，通过RT-PCR方法检测E6／E7基因的表达。结果通过同源重组的方法构建了腺病毒pAd-K14E6／E7-polA载体，经酶切和测序鉴定该质粒构建成功。293细胞包装3d后观察到绿色荧光蛋白（GFP）表达，CsCl梯度离心纯化最终获得7．2×10^10pfu／mL滴度的重组病毒；用该滴度病毒重新感染293细胞3d后，提取细胞总RNA，RT-PCR检测E6／E7有表达。结论利用新型腺病毒载体AdEasy系统可在短期内制备同时表达GFP和E6／E7的重组腺病毒pAd-K14-E6／E7-polA。这将为进一步研究HPV-16E6／E7基因功能及利用基因治疗女性宫颈癌奠定了基础。