利用滤除白细胞分离培养自然杀伤细胞方法的优化

• Published in: 中华肿瘤杂志 Vol. 38; no. 2; pp. 105 - 112
• Main Author: 靳保利 郭继强 韩亚萍 李芳 赵晴 李文丽 张德梅 王华 张俊萍
• Format: Journal Article
• Language: Chinese
• Published: 山西医科大学第二临床医学院, 太原,030001%山西医学科学院 山西大医院肿瘤内二科, 太原,030032%山西省血液中心, 太原,030024 2016
• Subjects: 杀伤细胞，天然; 白细胞分离术; 细胞培养技术; 细胞移植; Cell culture techniques; 白细胞分离术; 杀伤细胞,天然; 细胞移植; Killer cells,natural; 细胞培养技术; Leukocyte reduction procedures; Cell transplantation
• ISSN: 0253-3766
• DOI: 10.3760/cma.j.issn.0253-3766.2016.02.006

目的利用制备血液制品中滤除的白细胞，体外诱导扩增自然杀伤细胞（NK），并对NK细胞的分离培养方法进行优化。方法收集15例健康献血者的新鲜外周血，将制备血液制品中滤除的白细胞回收，经密度梯度离心法获得外周血单个核细胞（PBMCs），每份样本分为CD3mAb组（包被CD3单克隆抗体）、CD16mAb组（包被CD16单克隆抗体）和CD16mAb＋CD3mAb组（包被CD16单克隆抗体和CD3单克隆抗体）。相同培养条件下，加入相同无血清细胞培养液和细胞因子培养、诱导扩增。在显微镜下观察细胞扩增倍数，采用流式细胞术检测细胞表型CD3-CD56＋细胞比例、NK细胞表面活化性受体的表达及细胞杀伤因子干扰素γ（IFN-γ）的分泌，采用乳酸脱氢酶（LDH）释放法及流式细胞术检测NK细胞对肿瘤细胞的细胞毒作用。结果培养第17天，CD3mAb组、CD16mAb组和CD16mAb＋CD3mAb组的CD3-CD56＋细胞比例分别为（15．19±12．22）％、（83．63±10．63）％和（49．40±12．64）％，而培养前CD3-CD56＋细胞比例为（16．34±10．51）％。CD16mAb组和CD16mAb＋CD3mAb组CD3-CD56＋细胞比例与CD3mAb组CD3-CD56＋细胞比例比较，差异有统计学意义（P〈0．05）。CD3mAb组、CD16mAb组和CD16mAb＋CD3mAb组的NK细胞总数均〉10^9个。流式细胞术检测结果显示，CD16mAb组培养前CD3-CD56＋细胞表面活化性受体CD314、CD335、CD337的表达率分别为（68．59±5．01）％、（20．94±3．48）％和（33．27±6．27）％，培养第17天分别为（73．63±4．50）％、（57．53±4．77）％和（64．65±4．18）％，培养前后CD314表达率的差异无统计学意义（P〉0．05），培养前后CD335、CD337表达率的差异有统计学意义（P〈0．05）。扩增后的NK细胞对肿瘤细胞K562的细胞毒作用在效靶比为40：1时可达到（76．97±3．16）％。结论滤除的白细胞经体外分离培养后可得到比例高达90％的NK细胞，其细胞总数〉10^9个，细胞活性增强，对肿瘤细胞具有较高的杀伤活性，可达到临床治疗肿瘤的应用标准。