Affordable de novo generation of fish mitogenomes using amplification‐free enrichment of mitochondrial DNA and deep sequencing of long fragments

• Published in: Molecular ecology resources Vol. 23; no. 4; pp. 818 - 832
• Main Authors: Ramón‐Laca, Ana, Gallego, Ramón, Nichols, Krista M.
• Format: Journal Article
• Language: English
• Published: England Wiley Subscription Services, Inc 01.05.2023
• Subjects: Amplification; Animals; Biomonitoring; Cas9 targeted sequencing; Cleavage; Community composition; Computer applications; CRISPR; Deoxyribonucleic acid; Depletion; DNA; DNA sequencing; DNA, Mitochondrial - genetics; eDNA; Enrichment; Fish; Fragments; Genes; Genome, Mitochondrial; Genomics; High-Throughput Nucleotide Sequencing - methods; long fragment; Mitochondria; Mitochondria - genetics; Mitochondrial DNA; mitochondrial enrichment; mitogenome; Nucleotide sequence; Sequence Analysis, DNA - methods; Workflow; mitochondrial enrichment; long fragment; Cas9 targeted sequencing; eDNA; mitogenome; fish
• ISSN: 1755-098X; 1755-0998
• DOI: 10.1111/1755-0998.13758

Biomonitoring surveys make use of metabarcoding tools to describe the community composition. These studies match their sequencing results against public genomic databases to identify the species. However, mitochondrial genomic reference data are yet incomplete, only a few genes may be available, or the suitability of existing sequence data is suboptimal for species level resolution. Here, we present a dedicated and cost‐effective workflow with no DNA amplification for generating complete fish mitogenomes for the purpose of strengthening fish mitochondrial databases. Two different strategies using long fragment sequencing with Oxford Nanopore technology coupled with mitochondrial DNA enrichment were used. One where the enrichment is achieved by preferential isolation of mitochondria followed by DNA extraction and nuclear DNA depletion (“mitoenrichment”). A second enrichment approach takes advantage of the CRISPR Cas9 targeted scission on previously dephosphorylated DNA (“targeted mitosequencing”). The sequencing results varied between tissue, species, and integrity of the DNA. The mitoenrichment method yielded 0.17%–12.33% of sequences on target and a mean coverage ranging from 74.9 to 805‐fold. The targeted mitosequencing experiment from native genomic DNA yielded 1.83%–55% of sequences on target and a 38 to 2123‐fold mean coverage. These produced complete mitogenomes of species with homopolymeric regions, tandem repeats, and gene rearrangements. We demonstrate that deep sequencing of long fragments of native fish DNA can be achieved with low computational resources in a cost‐effective manner, opening the discovery of mitogenomes of nonmodel or understudied fish taxa to a broad range of laboratories worldwide. Resumen Los estudios de biomonitoreo utilizan herramientas de caracterización genética (metabarcoding) para describir la composición de la comunidad. Estos estudios contrastan las secuencias obtenidas con bases de datos genómicas públicas para así identificar la especie. Sin embargo, las bases de datos mitocondriales de referencia distan mucho de estar completas. En la mayor parte de los casos solo hay unos pocos genes disponibles o los datos existentes no ofrecen resolución hasta el nivel de especie. En este estudio presentamos un método dedicado a generar mitogenomas de peces completos de forma rentable y sin necesidad de amplificación del ADN, con el objeto de ampliar las bases de datos mitocondriales de peces. Para ello se utilizaron dos enfoques diferentes de secuenciación de fragmentos largos utilizando secuenciación Oxford Nanopore y enriquecimiento de ADN mitocondrial. Uno en el que el enriquecimiento se logra mediante el aislamiento preferencial de mitocondrias seguido de extracción del ADN y la eliminación del ADN nuclear (“mitoenriquecimiento”). En el segundo enfoque se aprovecha la capacidad de escisión dirigida por la endonucleasa CRISPR‐Cas9 sobre ADN previamente desfosforilado (“mitosecuenciación dirigida”). Los resultados difirieron con el tejido, la especie y la integridad del ADN. El método de mitoenriquecimiento produjo un 0,17%–12,33% de secuencias objetivo y una cobertura media entre 74,9 y 805 secuencias. El experimento de mitosecuenciación dirigida a partir de ADN genómico nativo produjo entre 1,83 y 55% de secuencias objetivo y una cobertura media de 38 a 2123 secuencias. Este estudio permitió completar mitogenomas de diferentes especies que incluyen regiones homopoliméricas, repeticiones en tándem y reorganización de genes. Demostramos que la secuenciación intensiva de fragmentos largos de ADN de peces es posible, se puede lograr con bajos recursos informáticos de una manera económica, superando el método generalizado de secuenciación genómica de baja cobertura y permitiendo el descubrimiento de mitogenomas de taxones de peces no modelo o poco estudiados a una amplia gama de laboratorios en todo el mundo.