Release, purification, and characterization of platelet-activating factor (PAF)

• Published in: Biochimie Vol. 62; no. 4; pp. 251 - 259
• Main Authors: Tencé, Martine, Polonsky, Judith, Le Couedic, Jean-Pierre, Benveniste, Jacques
• Format: Journal Article
• Language: English
• Published: France Elsevier Masson SAS 01.01.1980
• Subjects: Acetophenones - chemistry; Blood Platelets - metabolism; Calcium - chemistry; Chromatography - methods; Edetic Acid - pharmacology; Facteur activant les plaquettes; Humans; Hydrogen-Ion Concentration; Leukocytes - metabolism; Lysophosphatidylcholines - chemistry; Mass Spectrometry; Phospholipases A - antagonists & inhibitors; Phospholipases A2; phospholipides; phospholipids; Phospholipids - chemistry; Plaquettes; Platelet; platelet activating factor; Platelet Activating Factor - chemistry; Silicic Acid - chemistry; Temperature; Facteur activant les plaquettes; LPE; phospholipides; PS; CI; Sph; TLC; phospholipids; CM-cellulose; QAE-Sephadex; TT-BSA; EGTA; platelet activating factor; BSA; Platelet; PC; PAF; PE; Plaquettes; LPC; HPLC
• ISSN: 0300-9084; 1638-6183
• DOI: 10.1016/S0300-9084(80)80399-3

Le « Platelet Activating Factor(P.A.F.) est un médiateur phospholipidique libéré par les basophiles, macrophages, neutrophiles, après stimulation immunologique et non immunologique. Il agrège les plaquettes et libère leurs amines vaso-actives. Nous avons étudié la libération « spontanéedu P.A.F. par les leucocytes de porc: les conditions optimales étaient une température de 22°C, un pH de 9,5 dans un tampon de Tyrode contenant de la sérum-albumine bovine et du Ca ++. Cette libération était inhibée par un agent chelatant le Ca ++, l'E.D.T.A. et par un inhibiteur des phospholipases, le bromure de bromophenacyl. Le P.A.F. n'était pas libéré par lyse cellulaire indiquant qu'il n'est pas un médiateur préformé. Une méthode préparative d'extraction et de purification du P.A.F. à partir de grands volumes de sang de porc a été développée. Le P.A.F. a été purifié par chromatographies sur colonne d'acide silicique à pression normale et à haute pression. La fraction active était éluée entre la sphingomyeline et la lysophosphatidyl choline. Ces deux phospholipides ont été retrouvés par chromatographie en couche mince et spectrométrie de masse par ionisation chimique à titre de contaminants dans les fractions P.A.F. les plus purifiées. Le traitement par le diazométhane, l'acétylation ou l'hydrogénation n'ont pas eu d'effet sur l'activité P.A.F. Ces résultats, combinés avec ceux obtenus lors d'études précédentes utilisant des phospholipases spécifiques, indiquent que le P.A.F. est un phospholipide dépourvu d'une liaison ester en position l. Ils permettent d'établir des critères précis afin de distinguer le P.A.F. d'autres agents agrégants. Platelet-activating factor (PAF) is a phospholipid mediator, released by basophils, macrophages and neutrophils under immunological and non immunological stimuli. It aggregates platelets and liberates their vasoactive contents. We studied the « spontaneousrelease of PAF from hog blood leukocytes: optimal conditions were 22°C, pH 9.5 in BSA and Ca 2+-containing Tyrode's. This release was inhibited by the Ca 2+-chelating agent, EDTA, and by the phospholipase A2 inhibitor, bromophenacyl bromide. Disruption of the cells did not yield PAF, indicating that it is not a « preformedmediator. A preparative procedure for the extraction and purification of bulk quantities of PAF was developed. Purification was performed by silicic acid columns followed by high pressure liquid chromatography. The active fraction was eluted between sphingomyelin and lysophosphatidylcholine. The PAF purest fractions were still contaminated with these phospholipids as shown by thin layer chromatography and chemical ionization mass spectrometry. PAF activity was not affected by treatment with diazomethane, acetylation or hydrogenation. Our results combined with those obtained from our previous studies of the PAF structure using specific phospholipases indicate that PAF is a glycero-phospholipid devoid of ester function at position 1. This allowed us to establish precise criteria to distinguish PAF from other aggregating agents.