Construction and identification of recombinant plasmids carrying cDNAs coding for ovine α s1-, α s2-, β-, κ-casein and β-lactoglobulin. Nucleotide sequence of α s1-casein cDNA

• Published in: Biochimie Vol. 67; no. 9; pp. 959 - 971
• Main Authors: Mercier, Jean-Claude, Gaye, Pierre, Soulier, Solange, Hue-Delahaie, Dominique, Vilotte, Jean-Luc
• Format: Journal Article
• Language: English
• Published: France Elsevier Masson SAS 01.09.1985; Elsevier
• Subjects: ADN; Amino Acid Sequence; Animals; ARN MENSAJERO; ARN MESSAGER; banque de DNA complémentaires; Base Sequence; Biochemistry, Molecular Biology; BREBIS; CASEIN; CASEINA; CASEINE; Caseins - genetics; caséine α s1; cDNA libray; Cloning, Molecular; CODE GENETIQUE; CODIGO GENETICO; DNA; DNA - metabolism; DNA Restriction Enzymes; DNA Transposable Elements; EWES; Female; GENETIC CODE; GLANDE MAMMAIRE; GLANDULAS MAMARIAS; Lactoglobulins - genetics; Life Sciences; MAMMARY GLANDS; Mammary Glands, Animal - metabolism; MESSENGER RNA; Nucleic Acid Hybridization; NUCLEOTIDE; nucleotide sequence; NUCLEOTIDES; NUCLEOTIDOS; OVEJA; ovins; Plasmids; Protein Biosynthesis; RNA, Messenger - genetics; RNA-messagers; Sheep; Sheep mamary gland; séquence nucléotidique; α s1-casein; nucleotide sequence; Sheep mamary gland; cDNA libray; ovins; caséine α s1; glande mammaire; α s1-casein; séquence nucléotidique; messenger-RNA; banque de DNA complémentaires; RNA-messagers; BANQUE DE GENES
• ISSN: 0300-9084; 1638-6183
• DOI: 10.1016/S0300-9084(85)80291-1

Une banque de DNA bicaténaires complémentaires des RNA poly(A) + extraits de la glande mammaire d'une brebis lactante, a été construite selon un protocole classique en utilisant comme enzymes la transcriptase inverse, la nucléase S1 et la transférase terminale. Les DNA bicaténaires insérés dans le site PstI du plasmide pBR322 ont été clonés dans E. coli. Les clones contenant les DNA complémentaires des RNA-messagers prédominants (forte hybridation avec une sonde monocaténaire de DNA obtenue par transcription inverse de RNA poly(A) + mammaire) ont été classés en cinq séries en utilisant successivement comme sonde le DNA inséré d'un clone non homologue. Le DNA recombinant d'un clone de chaque série a été identifié par hybridation-traduction du RNA-messager complémentaire puis immunoprécipitation et électrophorèse de la protéine synthétisée. La taille des RNA-messagers des caséines α s1, α s2, β, κ et de la β-lactoglobuline a été déterminée selon la technique dite de Northern. Cinq RNA-messagers homologues de tailles similaires ont été caractérisés dans l'espèce porcine en utilisant comme sondes les DNA complémentaires ovins. La séquence nucléotidique du RNA-messager de la caséine α s1 ovine a été déduite de l'analyse d'un DNA complémentaire bicaténaire de 1080 paires de bases et d'un DNA monocaténaire de 268 nucléotides obtenu par élongation d'un fragment 5′ du DNA bicaténaire précédent, utilisé comme amorce. Le RNA-messager de la caséine α s1 ovine (1110 nucléotides, poly(A) exclus) comporte une séquence codante de 618 nucléotides flanquée en 5′ et 3′ de régions non codantes de 61 et 431 nucléotides. La comparaison des RNA-messagers des caséines α s1 ovine, bovine, de rat et de cobaye a révélé une plus grande homologie dans les régions non codantes 3′ et surtout 5′. Dans la partie codante, les seules régions réellement conservées sont surtout celles correspondant au peptide signal et aux phosphopeptides. La séquence de la précaséine α s1 ovine (206 résidus d'acides aminés) déduite de ces données diffère de celle de son homologue bovine par 24 substitutions d'acides aminés et une délétion de 8 acides aminés. Une telle différence entre deux espèces très proches sur la plan phylogénétique traduit une évolution très rapide de ce type de caséine. An ovine mammary cDNA library has been constructed from total poly(A) + RNA isolated from the mammary gland of a lactating ewe, using a classical procedure. Blunt-ended double-stranded cDNAs prepared with reverse transcriptase and nuclease S1 were tailed with dCTP, inserted into the dGMP-tailed PstI site of plasmid pBR322 and cloned in E. coli. Five series of homologous clones representing abundant messenger RNAs (strong hybridization with a single-stranded cDNA probe generated from total poly(A)+ RNA) were selected using each time a different predominant cloned ds-cDNA as probe, then identified by positive hybridization-translation of the cognate mRNA and subsequent immunoprecipitation and electrophoresis of the protein. The lengths of α s1-, α s2-, β-, k-casein and β-lactoglobulin mRNAs are in the range of 1.2, 1.1, 1.25, 1.0 and 0.85 kb, respectively, as determined by Northern blotting analysis. Five homologous mRNAs of similar sizes were identified in the porcine species by dot blot hybridization and Northern analyses. The nucleotide sequence of α s1-casein mRNA was determined by sequencing, according to Maxam and Gibert, both a 1080 bp long cloned ds-cDNA and a ss-cDNA (268 nucleotides) generated by 5′ extension of a 5′ terminal truncated radiolabeled fragment (83 bp) of the relevant ds-cDNA, used as primer for reverse transcription. The 3′ non coding region (431 nucleotides, excluding the poly(A) tail) represents 70 % of the length of the coding region (618 nucleotides) flanked by a 61 nucleotide 5′ region. Comparison of sequences of ovine and bovine, rat and guinea-pig α s1-casein mRNAs has revealed a greater homology in the 3′ and especially 5′ non coding regions. In the reading frame, the conserved regions are essentially those corresponding to the signal peptide and phosphopeptide domains. The derived 206 amino acid sequence of ovine pre-α s1-casein differs from that of its bovine counterpart (genetic variant B) by 24 amino acid substitutions and a deletion of 8 amino acid residues occurring in the polypeptide chain of the mature protein. Such a variation (84 % homology only) in two phylogenetically closely related species indicates a high rate of evolution of α s1-casein.