Rapid, easy, sensitive, low‐cost and on‐site detection of environmental DNA and RNA using CRISPR‐Cas13

• Published in: Methods in ecology and evolution Vol. 15; no. 8; pp. 1408 - 1421
• Main Authors: Yang, Jiwei, Matsushita, Shoma, Xia, Fei, Yoshizawa, Susumu, Iwasaki, Wataru
• Format: Journal Article
• Language: English
• Published: London John Wiley & Sons, Inc 01.08.2024; Wiley
• Subjects: Amplification; Biodiversity; Centrifugation; Conservation; Conservation biology; CRISPR; CRISPR‐Cas; Cyprinus carpio; Deoxyribonucleic acid; DNA; Environmental DNA; Fisheries; Geographical distribution; Introduced species; Invasive fish; Invasive species; Mitochondrial DNA; Nuclease; Nucleic acids; Oryzias latipes; Polymerase chain reaction; real‐time PCR; Recombinase; recombinase polymerase amplification; Reverse transcription; Ribonucleic acid; RNA; Sensitivity; species‐specific detection; Threatened species
• ISSN: 2041-210X; 2041-210X
• DOI: 10.1111/2041-210X.14369

Environmental DNA (eDNA) monitoring of species distribution has become a critical tool in ecology, conservation biology and fisheries for identifying the presence and distribution of diverse organisms, including important, threatened and invasive species. However, eDNA detection still has room for improvement in sensitivity, requiring time‐consuming real‐time polymerase chain reaction (qPCR) steps and costly machines. In this study, we report a CRISPR‐Cas13‐based method for rapid, easy, sensitive, low‐cost and on‐site detection of eDNA. The assay for the detection of common carp (Cyprinus carpio) and medaka (Oryzias latipes) nucleic acid employs a two‐step process, starting with recombinase polymerase amplification (RPA) and followed by cleavage using Cas13 nuclease, to effectively identify mitochondrial DNA or RNA. Our results showed that the Cas13‐based method has a higher sensitivity than the qPCR‐based method in detecting tiny amounts of eDNA. When combined with reverse transcription of environmental RNA (eRNA), our method increased detection sensitivity by approximately one order of magnitude. Cas13‐based detection could achieve on‐site detection of eDNA using a quick nucleic acid extraction solution and lateral flow strips. Cas13‐based detection of eDNA and eRNA requires minimal training efforts and can be performed in 1 h, without the need for centrifugation and qPCR machines. The portability of the Cas13‐based method, along with its accuracy and relative ease in designing primers and CRISPR RNA (crRNA), underscores its potential to broaden the application of eDNA and eRNA in various fields, including biodiversity conservation. 要旨 環境DNA(Environmental DNA; eDNA)技術に基づく生物分布モニタリングは、経済的に貴重な種、絶滅危惧種、侵入種等の分布を比較的簡便に同定することができるため、生態学、保全生物学、漁業において重要なツールとなっている。しかし、定量的ポリメラーゼ連鎖反応(quantitative polymerase chain reaction; qPCR)に基づくeDNA検出は、時間がかかるだけでなく高価な機器が必要であり、感度にも改善の余地がある。 本研究では、高感度でありながら迅速・簡便・低コストで、かつフィールドにおいて実行可能なCRISPR‐Cas13技術に基づくeDNA検出法を提案する。本方法は、まずリコンビナーゼポリメラーゼ増幅(recombinase polymerase amplification; RPA)によって目的の核酸配列を増幅し、次にCas13ヌクレアーゼが増幅された配列を認存し、コラテラル切断活性により異なる種に由来する配列を効果的に存別する。 コイ(Cyprinus carpio)とメダカ(Oryzias latipes)のミトコンドリアDNAおよびRNAを標的とした性能評価の結果、微量のeDNA検出において、qPCRよりもCas13を用いた本手法のほうが高感度であることが示された。また、環境RNA(Environmental RNA; eRNA)の逆転写と本手法を組み合わせると、その検出感度は約一桁向上した。さらに、迅速な核酸抽出溶液とラテラルフローストリップを用いることで、現場でのeDNA検出を実現することができた。 Cas13を用いたeDNAおよびeRNA検出は、遠心分離やqPCR機器を必要とせず、最小限のトレーニングで1時間以内に実施可能である。本手法の携帯性と精度、そしてプライマーやCRISPR RNA(crRNA)設計の容易さは、生物多様性の保全を含む様々な分野でのeDNAおよびeRNA解析技術の応用を広げる可能性がある。 摘要 环境DNA(Environmental DNA; eDNA)技术已成为生态学、保护生物学和渔业科学中物种监测的关键工具，用于识别重要、受威胁和入侵物种的存在及分布。然而，目前eDNA检测的灵敏度仍有提升空间，且依赖耗时的荧光定量聚合酶链式反应(quantitative polymerase chain reaction; qPCR)和昂贵的设备。 本研究报告了一种基于CRISPR‐Cas13的方法，用于快速、简便、灵敏、低成本的现场eDNA检测。该方法首先通过重组酶聚合酶反应(recombinase polymerase amplification; RPA)扩增目标核酸序列，再利用Cas13核酸酶识别扩增序列并产生旁切活性，从而区分不同物种的序列。 针对鲤鱼(Cyprinus carpio)和青鳉(Oryzias latipes)的线粒体 DNA 和 RNA的检测结果表明，相对于qPCR，基于Cas13的方法在检测微量eDNA时具有更高的灵敏度。逆转录环境RNA(Environmental RNA; eRNA)可进一步将该方法的检测灵敏度提高约一个数量级。此外，基于Cas13的方法可兼容快速核酸提取试剂和免疫层析试纸条，实现现场eDNA检测。 基于Cas13的eDNA和eRNA检测仅需极少的培训，无需离心和qPCR设备，可在一小时内完成。该方法具有便携性、准确性，以及引物和CRISPR RNA(crRNA)设计的相对简便性，在生物多样性保护等领域中展现出极大的应用潜力。