Enrichment of rhodopsin in rod outer segment membrane preparations

• Published in: Vision research (Oxford) Vol. 12; no. 10; pp. 1697 - 1707
• Main Authors: de Grip, W.J., Daemen, F.J.M., Bonting, S.L.
• Format: Journal Article
• Language: English
• Published: Elsevier Ltd 01.10.1972
• ISSN: 0042-6989; 1878-5646
• DOI: 10.1016/0042-6989(72)90040-5

Substantial, seasonally varying amounts of opsin are present in cattle rhodopsin preparations, which cannot be converted to rhodopsin by prior dark adaptation of the excised eyes. A method is described for the quantitative conversion of the opsin to rhodopsin by treatment of a rod outer segment preparation with 11- cis retinaldehyde, followed by removal of excess retinaldehyde through reduction by endogenous retinol dehydrogenase and added NADPH and elution of the resulting retinol by sucrose gradient centrifugation. The resulting rhodopsin preparation has a high pigment content of 8 nMol/mg dry weight, which is constant within 2.5 per cent over the entire year. The preparation is of high purity, as indicated by theA 278/A 500 ratio of 2.0–2.5 and theA 400/A 500 ratio of 0.20–0.26. The yield is high, representing 50 per cent of the pigment present in the retina. The preparation is free of detergent, has a full regenerating capacity, and can be stored for long periods of time. Dans les pre´parations de rhodopsine de be´tail, on trouve des quantite´s importantes d'opsine,a`variation saisonnie`re, et qui ne peuvent paseˆtre converties en rhodopsine par adaptation pre´alablea`l'obscurite´des yeuxe´nucle´e´s. On de´crit une me´thode pour la conversion quantitative de l'opsine en rhodopsine par traitement d'une pre´paration de segments externes de baˆtonnets avec de la retinalde´hyde 11- cis, suivi par l'enle`vement de la retinalde´hyde en exce`s par re´duction au moyen de la de´hydroge´nase en-doge`ne du re´tinol, addition de NADPH ete´lution du re´tinol re´sultait par centrifugation en gradient de sucrose. La pre´paration de rhodopsine qui en re´sulte contient une forte proportion de pigment (8 nMol/mg de poids sec) qui reste constantea`2,5 pour cent pre`s toute l'anne´e, La pre´paration est tre`s pure, comme l'indique k rapportA 278/A 500 de 2.0–2.5 et le rapportA 400/A 500 de 0.20–0.26. Le rendement este´leve´et repre´sente 50 pour cent du pigment pre´sent dans la re´tine. La pre´paration ne contient pas de de´tergent, posse`de une capacite´totale de re´ge´ne´ration et peuteˆtre conserve´e pendant de longues pe´riodes de temps. In Rhodopsin-Pra¨parationen von Rindernetzha¨uten werden wesentliche, sich mit der Jahreszeita¨ndernde Mengen von Opsin gefunden, die dutch vorhergehende Dunkeladaptation der pra¨parierten Augen nicht in Rhodopsin umgewandelt werden ko¨nnen. Es wird eine Methode zur quantitativen Umwandlung von Opsin in Rhodopsin durch Behandlung dera¨uβeren Stabchensegmente mit 11-cis-Retinen-Aldehyd beschrieben. Dasu¨berschu¨ssige Retinen-Aldehyd wird durch Reduktion mit endogener Retinoldshydrogenase und Zusatz von NADPH und Ausscheidung des entstehenden Retinols durch Zentrifugieren nach dem Rohrzuckergehalt entfernt. Das entstehende Rhodopsinpra¨parat hat einen hohen Pigmentgehalt mit einem Trockengewicht von 8 nmol/mg, der bis auf 2,5%U¨ber das ganze Jahr konstant ist. Das Pra¨parat hat einen hohen Reinheitsgrad, wie sich durch das Absorptionsverha¨ltnisA 278/A 500 von 2.0–2.5 und das Absorptionsverha¨ltnisA 400/A 500 von 0.20–0.26 zeigt. Die Ausbeute ist mit 50 Prozent des in der Retina vorhandenen Pigments hoch. Das Pra¨parat ist fini von Reinigungsmitteln, ist voll regenerationsfa¨hig und kannU¨ber lange Zeit aufbewahrt werden. B пpeпapaтaх poдoпcинa кpyпнoгo poгaтoгo cкoтa coдepжитcя знaхитeльнoe, мeняюшeecя в зaвиcимocти oт вpeмeни гoдa, кoлихecтвo oпcинa, кoтopoe нeльзя пepeвecти в poдoпcин пocлe пpeдвapитeльнoй тeмнoвoй aдaптaции вcкpытoгo глaзa. Oпиcaн мeтoд кoлихecтвeннoгo пpeвpaщeния oпcинa в poдoпcин пpи oбpaбoткe пpeпapaтoв нapyжных ceгмeнтoв пaлoхeк 11- циc peтинaльдeгидoм, вcлeдзa yдaлeниeм избыткa peтинaльдeгидa, блaгoдapя вoccтaнoвлeнию эндoгeннoй peтинoлдeгидpoгeнaзoй c дoбaвлeниeм NADPH и yдaлeнию oбpaзyющeгocя peтинoлa c пoмoщью цeнтpифyгиpoвaния в гpaдиeнтe caхapoзы. Пoлyхaющийcя пpeпapaт poдoпcинa имeeт выcoкoe coдepжaниe пигмeнтa—8 нMoль/ мг cyхoгo вeca, кoтopoe пocтoяннo в пpeдeлaх 2,5% cвышe гoдa. Пpeпapaты являютcя выcoкo хиcтыми, кaк yкaзывaeт oтнoшeниeA 278/A 500 —2,0–2,5 и oтнoшeниeA 278/A 500 —0.2–0.26. Bыхoд выcoкий, cooтвeтcтвyющий 50% пигмeнтa, coдepжaщeгocя в ceтхaткe. Пpeпapaты бeз дeтepгeнтa oблaдaют пoлнoй peгeнepaтивнoй cпocoбнocтью и мoгyт хpaнитьcя в тeхeниe длитeльнoгo вpeмeни.