SD乳鼠原代皮质神经元及星形胶质细胞同时培养的实验方法 - 明江; 廖益东; 宋文学; 穆德勇; 刘宗伟; 徐卡娅 (中国组织工程研究, 2023)
R459.9%R318%R651; 背景:目前获取原代皮质神经元和星形胶质细胞的方法很多,传统方法通常是分别获取这两种细胞,但实验方法过于繁琐且浪费实验材料.找到一种简单、经济、可行并同时提取这两种细胞的培养方法尤为重要.目的:观察同时提取培养SD乳鼠大脑皮质神经元及星形胶质细胞的效果及注意事项.方法:选用出生24 h内的SD乳鼠,用体积分数为75％乙醇浸泡消毒,待乳鼠昏迷后断脊处死,沿乳鼠颈部用剪刀离断头颅并放入装有高糖DMEM的小烧杯中,沿矢状缝打开头颅并取出大脑放入盛有高糖DMEM的培养皿中.在冰上剥出脑膜及血管,夹取皮质表面2.0-3.0 mm的脑组织,通过木瓜酶和DNA酶进行消化20 min,用含有体积分数为10％胎牛血清的DMEM/F12终止消化.以细胞浓度为1.0×109 L-1种植于含有爬片(用多聚赖氨酸处理)的6孔板中,分别于1,3,5,7 d通过倒置荧光显微镜下观察神经元的形态变化,使用Calcien-AM进行活细胞染色观察细胞活性,β-Tubulin、MAP2免疫荧光染色对神经元进行鉴定.将剩余大脑皮质进行星形胶质细胞的提取,经过胰酶消化、过滤、吹打,以适宜的浓度接种于培养瓶中,待细胞融合度达到90％时,进行恒温水平摇床振荡24 h以纯化星形胶质细胞.当细胞传代纯化后以1.0×109 L-1接种于6孔板中培养,GFAP免疫荧光染色对星形胶质细胞进行鉴定.结果 与结论:①培养1 d后可见神经元贴壁生长,胞体增大,部分聚集生长,细胞间有少量的突触连接;培养3,5 d后胞体进一步增大,突触增粗伸长相互连接;培养7 d后神经元明显聚集,突触增长增粗,相互连接形成致密的细胞网.Calcien-AM活细胞染色可见神经元活性较好,经β-Tubulin、MAP2免疫荧光鉴定细胞纯度大于90％.②培养3 d后星形胶质细胞胞体增大,呈现梭状、不规则状,细胞间出现少量相互连接,细胞间存在较多小胶质细胞;培养5 d后胞体、突起进一步增大;培养7 d发现细胞间的小胶质细胞及其他杂质明显减少,背景较为干净.经GFAP免疫荧光鉴定细胞纯度大于95％.③此方法获得的皮质神经元和星形胶质细胞形态好、杂质少、纯度高,可满足神经科学研究对高纯度的皮质神经元及星形胶质细胞的需求.