Characterization of canine filaggrin: gene structure and protein expression in dog skin

• Published in: Veterinary dermatology Vol. 24; no. 1; pp. 25 - e7
• Main Authors: Kanda, Satoko, Sasaki, Takashi, Shiohama, Aiko, Nishifuji, Koji, Amagai, Masayuki, Iwasaki, Toshiroh, Kudoh, Jun
• Format: Journal Article
• Language: English
• Published: Oxford, UK Blackwell Publishing Ltd 01.02.2013
• Subjects: Animals; Base Sequence; Blotting, Western; DNA - genetics; Dogs; Gene Expression Regulation - physiology; Genomics; Immunohistochemistry - veterinary; Intermediate Filament Proteins - genetics; Intermediate Filament Proteins - metabolism; Molecular Sequence Data; Skin - metabolism
• ISSN: 0959-4493; 1365-3164
• DOI: 10.1111/j.1365-3164.2012.01105.x

Background –  Filaggrin (FLG) is a key protein for skin barrier formation and hydration of the stratum corneum. In humans, a strong association between FLG gene mutations and atopic dermatitis has been reported. Although similar pathogenesis and clinical manifestation have been argued in canine atopic dermatitis, our understanding of canine FLG is limited. Hypothesis/Objectives –  The aim of this study was to determine the structure of the canine FLG gene and to raise anti‐dog FLG antibodies, which will be useful to detect FLG protein in dog skin. Methods –  The structure of the canine FLG gene was determined by analysing the publicly available canine genome DNA sequence. Polyclonal anti‐dog FLG antibodies were raised based on the canine FLG sequence analysis and used for defining the FLG expression pattern in dog skin by western blotting and immunohistochemistry. Results –  Genomic DNA sequence analysis revealed that canine FLG contained four units of repeated sequences corresponding to FLG monomer protein. Western blots probed with anti‐dog FLG monomer detected two bands at 59 and 54 kDa, which were estimated sizes. The results of immunohistochemistry showed that canine FLG was expressed in the stratum granulosum of the epidermis as a granular staining pattern in the cytoplasmic region. Conclusions and clinical importance –  This study revealed the unique gene structure of canine FLG that results in production of FLG monomers larger than those of humans or mice. The anti‐dog FLG antibodies raised in this study identified FLG in dog skin. These antibodies will enable us to screen FLG‐deficient dogs with canine atopic dermatitis or ichthyosis. Résumé Contexte –  La filaggrine (FLG) est une protéine clé de la formation de la barrière cutanée et de l’hydratation du stratum corneum. Chez l’homme, une forte association entre les mutations du gène FLG et la dermatite atopique a été rapportée. Bien qu’une pathogénie et des manifestations cliniques similaires soient soutenues dans la dermatite atopique canine, notre compréhension de la FLG canine est limitée. Hypothèse/Objectives –  Le but de cette étude était de déterminer la structure du gène FLG canin et de sélectionner des anticorps anti‐FLG canin, qui seront utiles pour détecter les protéines FLG dans la peau du chien. Méthodes –  La structure du gène FLG canin a été déterminée par l’analyse de la séquence d’ADN du génome canin accessible au public. Des anticorps polyclonaux anti‐FLG canin ont été identifiés sur base de l’analyse de séquence de la FLG canine et utilisés pour définir le patron d’expression de la FLG dans la peau de chien par western blot et immunohistochimie. Résultats –  L’analyse de la séquence d’ADN génomique a révélé que la FLG canine contenait quatre unités de séquences répétées correspondant à la protéine monomère FLG. Les Western blots avec des sondes anti‐monomères de FLG ont détectés deux bandes à 59 et 54 kDa, qui étaient les tailles estimées. L’immunohistochimie a montré que la FLG canine est exprimée dans le stratum granulosum de l’épiderme comme un patron de coloration granulaire dans la région cytoplasmique. Conclusions et importance clinique –  Cette étude a révélé la structure génétique unique de la FLG canine qui entraîne la production de monomères de FLG plus gros que ceux des humains ou des souris. Les anticorps anti‐FLG canine identifiés dans notre étude a identifié la FLG dans la peau du chien. Ces anticorps nous permettront d’identifier les chiens déficients en FLG atteints de dermatite atopique canine ou d’ichtyose. Resumen Introduccion –  la filagrina (FLG) es una proteína dominante para la formación de la barrera de la piel y la hidratación del estrato corneo. En seres humanos se ha indicado la existencia de una asociación marcada entre las mutaciones del gen de FLG y la presencia de dermatitis atópica. Aunque se ha sugerido una patogenia y manifestaciones clínicas similares en la dermatitis atópica canina, nuestra comprensión de la FLG canina es limitada. Hipótesis/ objetivos –  el propósito de este estudio fue determinar la estructura del gen de la FLG canina y producir los anticuerpos frente a la FLG canina, que serán útiles para detectar la proteína FLG en la piel de perro. Métodos –  la estructura del gen de la FLG canina fue determinada analizando la secuencia de dominio público del DNA genómico canino. Anticuerpos policlonales frente a la FLG canina se produjeron basados en la secuencia de la proteína y se utilizaron para definir el patrón de expresión de la FLG en la piel del perro por westernblot e inmunohistoquímica. Resultados –  el análisis de la secuencia del DNA genómico indicó que la FLG canina tenía cuatro unidades de secuencias repetidas correspondiendo al monómero de FLG. El westernblot con anticuerpos frente al monómero de FLG canina detectó dos bandas de 59 y 54 kDa, que fueron tamaños estimados. Los resultados de la inmunohistoquímica demostraron que la FLG canina se expresaba en el estrato granuloso de la epidermis con un patrón granular en la región citoplásmica. Conclusiones e importancia clínica –  este estudio reveló la estructura única del gen de la FLG canina que da lugar a la producción de los monómeros de FLG de mayor tamaño que los de seres humanos o de ratones. Los anticuerpos frente a la FLG canina producidos en este estudio identificaron la FLG en la piel de perro. Estos anticuerpos nos estudiar perros deficientes en FLG con dermatitis atópica o ictiosis caninas. Zusammenfassung Hintergrund –  Filaggrin (FLG) ist ein Schlüsselprotein für die Bildung der Hautbarriere und der Hydrierung des Stratum Corneum. Beim Menschen wurde ein deutlicher Zusammenhang zwischen FLG Genmutationen und atopischer Dermatitis beschrieben. Obwohl eine ähnliche Pathogenese und klinische Manifestation bei der atopischen Dermatitis des Hundes diskutiert wird, ist unser Verständnis des caninen FLG limitiert. Hypothese/Ziele –  Das Ziel dieser Studie war es, die Struktur des caninen FLG Gens zu bestimmen und Antikörper gegen FLG des Hundes zu produzieren, die beim Auffinden von FLG Protein in der Hundehaut hilfreich sein werden. Methoden –  Die Struktur des caninen FLG Gens wurde unter Verwendung der öffentlich verfügbaren Sequenz des DNA‐Genoms des Hundes bestimmt. Polyklonale anti‐Hund FLG Antikörper wurden basierend auf der Sequenzanalyse des caninen FLG erzeugt und dazu verwendet, das Muster der FLG Exprimierung in der Hundehaut mittels Westernblotting und Immunhistochemie zu definieren. Ergebnisse –  Die Sequenzanalyse der DNA Sequenz des Genoms zeigte, dass canines FLG vier Einheiten einer sich wiederholenden Sequenz beinhaltete, welche mit dem Protein des FLG Monomers übereinstimmte. Westernblots, bei denen als Probe das anti‐Hund FLG Monomer verwendet wurde, zeigten zwei Banden bei 59 und 54 kDa, wobei es sich um geschätzte Größen handelte. Die Ergebnisse der Immunhistochemie zeigten, dass canines FLG im Stratum granulosum der Epidermis in Form eines granulären Farbmusters in der zytoplasmatischen Region exprimiert wurde. Schlussfolgerungen und klinische Bedeutung –  In dieser Studie konnte die einzigartige Genstruktur des caninen FLG dargestellt werden, welches in der Entstehung von FLG Monomeren resultiert, die größer sind als die von Menschen oder Mäusen. Die anti‐Hund Antikörper, die in dieser Studie erzeugt wurden, identifizierten FLG in der Hundehaut. Diese Antikörper werden es uns ermöglichen, Hunde mit FLG Mangel bei atopischer Dermatitis oder Ichthyose herauszufiltern.